环境因子对井冈素发酵调控的影响及其机制探索.pdf

摘要 井冈霉素又名有效霉素A，是我国及东南亚地区应用最广的防治真菌病害的 农用抗生素之一，对水稻纹枯病的防治效果最佳。通过环境因子筛选得到对发酵 有促进作用的重要因子对工jlp化生产提商产量降低生产成本具有重要参考价值。 在吸水链霉菌5008发酵生产井冈霉素的过程中受到一系列环境因子的影响，在 细胞内产生多层面的响应与应激，从而影响到次级代谢物井冈霉素的产量和产素 效率。本研究从影响井冈霉索发酵的环境囚子筛选入手，考察了有机溶剂、温度、 植物油、氨基酸、y_丁内酯、脲等因素对发酵的影响，筛选到乙醇、氨基酸、P 丁内酯和脲等多个对井冈霉素生产有促进作用的因素。由于乙酵的效果最为明 显，详细考察乙醇影响下的井冈霉素的发酵，通过乙醇添加使井冈霉素产量提高 至约20 2／l’增产近60％。确立了通过乙醇添加促进井冈霉素增产的最优添加策 略，为醇类添加提高其它抗生素产譬提供了借鉴。 发酵12h时添加微量乙醇，使产素效率得到大幅提高，而且细胞发酵后期 自溶变慢。进一步使用qRT-PCR测定了乙醇处理组与对照组在4i同发酵时期的 井冈霉素生物合成必需的8个基冈所在的3个操纵子的转录水平以及全局调控基 因的表达。研究发现乙醇处理后对数期样品结构基因valABC、valKLMⅣ、vaIG 和全局调控基冈够R、glnR转录水平都迅速提高。咖尺和glnR的调控都需蛋白 激酶的介导，因此使用蛋白激酶抑制剂与乙醇同时添加，结果显示可使产量恢复 到原始水平。外源乙醇添加后，也可观察到胞内乙醇浓度的提高和胞内活性氧信 号分子的响应，同时伴随培养液颜色的加深。在动物细胞中乙醇可作为分子信号 诱导胞内活性氧产生，调节细胞的生长与凋亡，但在微牛物体系中尚无深入研究， 特别是我们观察到乙醇与活性氧信号的相关性，为进一步以链霉菌为模型研究两 种信号分子对次级代谢的调控机理和作用方式提供了重要信息。 井冈霉素的合成与碳代谢密切相关，乙醇处理组在处理后的48h内，胞内 磷酸戊糖途径的关键酶6．磷酸葡萄糖脱氢酶和糖酵解途径的关键酶3．磷酸甘油 醛脱氢酶都具有更高的酶活。可见，微量乙醇的添加除可影响吸水链霉菌的发酵 颜色、细胞状态外，还可以增强主代谢使井冈霉素获得更多的合成前体。加之前 l 面提到由其引起胞内活性氧和全局调控因子的响应，调控胞内信号转导途径对其 结构基因进行调节，结构基因的高表达也将带来井冈霉素产素效率的提高。本研 究从信号转导、基因转录、酶活力及代谢流分布角度揭示了微量乙醇影响下的井 冈霉素合成效率提高的机制，其研究方法和思路在其它次级代谢物发酵调控研究 中具有参考价值。 关键词：井冈霉素，吸水链霉菌，发酵，环境因素，乙醇，次级代谢，基因转录， 信号转导，酶活力 lI Abstract Aisoneofthemost used antibiotics Validamycin widelyagricultural against sheath East rice diseases，inAsia．Screening diseases，especiallyblight plantfungal toenhancethe of Ais for environmentalfactors helpful key productionvalidamycin of A costsinfactories．Fermentation for the validamycinby reducingproduction