利用寡核苷酸芯对roundup ready转基因大豆检测及鉴定技术的研究.pdfVIP

摘要 面对愈来愈复杂的正在研究和即将上市的转基崮植物，传统的目前应用最广泛的PCR专盒测技 术己不能完全满足大最、快速和对未知转基因产品检测的要求。慕因芯片技术的出现，实现了对 样品的高通量检测与筛选，检测效率是传统检测手段的成百J_：千倍。但目前基因芯片技术(寡核 苷酸微阵列)应用于转基因检测的研究还仅仅处于初期阶段。 本研究选取其遗传背景信息清楚，商业化应用非常广泛的转基因模式植物．Roundup Ready转 基因大豆作为丰要研究材料，Btl76和B111转基因玉米为辅助研究材料，将寡核苷酸芯片检测技 术应用于RoundupReady转基凶大豆检测及鉴定的研究，对以下几方面的问题进行了研究和探 讨。 一、针对RoundupReady转基因大豆的基因盒结构及其它对照转基因材料就筛选基因，种属 相关基因．目的基因，交联结构基因，特异结构基因等15个基因进行了普通PCR扩增并测序鉴定。 每个基因的扩增都以转基因和非转基因模板DNA对照进行。结果表明．按CTAB法提取的DNA符 台PCR扩增要求，转基凶和非转基因模板DNA对每个目的基因的扩增都与预期结果一致，说明 PCR反应体系正常，模板DNA未被污染。对每个目的片段的直接测序结果与设计的引物扩增片段 序列相符。 Ready转基因大豆的寡核昔酸答片：测序结果包含捺针序列或 二、制备检铆4及鉴定Roundup 互补序列，所产生的有效信号与预期结果一致，与凝胶电泳检测结果相符，表明所制备的寡核苷 酸芯片特异性好；寡核苷酸芯片检测灵敏度及特异性要优干凝胶电泳法检测。 三、对芯片检测巾常用的曲种荧光标记法．随机引物荧光标记法和PCR反应荧光标记法进行了 比较研究。从检测特异性，信号强度，信噪比指标进行综合评价，对转基因检测的寡核菅酸芯片 配合PCR反应荧光标记法为佳。 四、针对RoundupReady转基因大豆建立及优化了两套多重PCR反应体系(分别为四重及五 重PCR反应)，两套多重．PCR产物混台杂交，可在一张芯片上同对检测8个j}琶关基因，从而文现利 Ready转基因大豆检测及棒定的目的。 用该寡核苷酸芯片完成giJRoundup 五、对Btt76和Btll转基斟玉米和非转基因玉米建立及优化了五蘑PCR反应体系：现有寡核苻 酸芯片可有效榆测及鉴定Btl76和Btll转基因玉米，确证该寡核苷酸芯片的特异性能良好。 六、针对影响多羲PCR产物杂交信号的有关因素进彳亍优化，并与通常使用的杂交体系进行比 较，结果表明，杂交时间宜为40#钟，SSC浓度宜采用5×sscP}-，杂交温度，甲酰胺浓度与通 常杂交条件无异，强调荧光标记好的PCR产物杂交前要进行变性处理。 本课飚的开展和研究结果为寡核苷酸芯片技术应用于转基因检铡作了有益的探索和研究，并 为今后实现制备更高密度寡核苷酸芯片扩大对转基因植物的检测奠定了基础。 modified Ready转基因大 关键词：GMO(geneticallyorganism)，寡核苷酸芯片，Roundup 再，多重PCR，检测及鉴定。 ABSTRACT Withmoreand more GMOunderresearchand traditional complicatedplants beingapproved，the and usedPCRdetectionmethodcanno meetthedemands a tofastdetect widely longer great quantity ofanknownGMO．The ofDNA a