基因输送中聚阳子非病毒载体的表征和优化.pdfVIP

基因输送中聚阳离子非病毒载体的表征和优化 摘 要 基因治疗 gene therapy 通过传递一个具有治疗效果的基因到特定的位置或 细胞 表达需要的蛋白或者取代 修复有问题的基因而成为治疗严重疾病的新希 望 由于DNA 是大的生物分子 难以有效地进入特定的细胞或组织 因此如何 将基因高效 安全地输送到特定的细胞或组织成为基因治疗中最关键的问题之 一 也就是基因输送 gene delivery 问题 在基因输送技术发展的几十年里 取得了令人瞩目的成果 但是还有一些问题急待解决 目前最重要的问题是构建 安全 有效的基因输送载体 特别是能通过静脉给药的方式将基因输送到特定位 置的安全载体 目前发展的基因输送技术中物理转染技术虽然简单 但是损伤比较大 一般 只能作用于体表组织 基因载体技术通过将基因装配在载体上 通过载体的帮助 将基因高效地输送到细胞中 目前发展的载体主要有病毒载体和非病毒载体 病 毒载体虽然显示了高的转染效率 但是存在体内试验的不安全性和后期制备难以 大规模生产等问题 因此研究者将视线转向更安全的基因载体 非病毒载体 聚阳离子非病毒载体 polycation 是带正电的阳离子聚合物 通过和带负电荷 的DNA 之间的电荷作用 将DNA 包装成一定大小的DNA 复合物 提高基因的 输送效率 聚阳离子非病毒载体由于在载体设计上灵活 可控性和安全性好等优 点 成为重要的基因载体 研究表明聚阳离子非病毒载体在通过静脉注射进行系统给药时稳定性差 缺 乏体内靶向机制 导致基因输送效率比较低 因此 聚阳离子非病毒载体系统需 要进一步的优化 目前主要的解决方法是在聚阳离子上连接亲水性聚合物 主要 是聚乙二醇 PEG 和靶向分子 PEG 能减少粒子之间的相互作用以及粒子与非 特异性蛋白之间的相互作用 靶向分子提供了体内的靶向机制 使载体能够将基 因带到特定的细胞或组织 1 连接了亲水性聚合物 PEG 和靶向分子的复杂聚阳离子体系在体内试验中确 实能够提高DNA 复合物的稳定性和靶向性 但是体内的研究结果一直不稳定 转染效率还是不能得到保证 我们认为 这个关键问题的解决不是仅仅改变体内 的输送条件和使用新的聚阳离子非病毒载体能够解决 根本的问题还是在体外 的载体控制上 复杂聚阳离子非病毒载体系统的组成 表面性质 功能分子的 装配状态等决定了聚阳离子非病毒载体在体内的输送和转染情况 但是对于这 样复杂的系统 一直缺乏体外的系统表征手段来控制和确证这个载体系统的组 成 一些问题难以找到根本的原因 本论文旨在于建立复杂聚阳离子非病毒载 体系统的表征手段 不仅为目前的载体系统提供质量控制的手段 以后使用的 新聚阳离子载体也会遇到这样的问题 也能够从本论文的研究方法得到借鉴 聚阳离子非病毒载体系统本身的特殊性 再加上亲水性聚合物和靶向分子的 连接 使得这个非病毒载体系统非常复杂 使得对这个复杂系统的表征非常困难 聚阳离子非病毒载体系统的表征包括聚阳离子本身的表征 连接了功能性分子 后聚阳离子的表征 功能性分子本身的表征 复杂聚阳离子与 DNA 形成 DNA 复合物后的表征以及功能性分子装配之后的表征等 我们建立了以聚赖氨酸为骨 架的聚阳离子非病毒载体 在聚阳离子骨架上连接亲水性聚合物 PEG 和靶向蛋 白 EGF 形成靶向型的聚阳离子非病毒载体系统 对这个系统进行优化和表征 工作 本论文包括以下几个方面 一 我们首先对聚阳离子载体系统的骨架进行表征 骨架包括简单的聚阳离 子聚赖氨酸 PLL 还包括连接了亲水性聚合物聚乙二醇的复杂骨架 PEG-g-PLL 我们采用应用最广泛的聚阳离子非病毒载体之一聚赖氨酸 PLL 为 DNA 包装的主体 将两种不同分子量的亲水性聚合物聚乙二醇 PEG 通过化学合成 的方法连接在PLL 的骨架上 形成PEG 修饰的聚阳离子载体PEG-g-PLL 聚赖 氨酸和聚乙二醇都是聚合物 具有一定的