柑橘高效遗传转体系的建立与类胡萝卜素代谢相关基因的遗传转化.pdf

摘要 柑橘是世界上最重要的水果之一，果实品质一直是柑橘育种追求的主要目标。 长期以来，童期长、珠心胚、性器官败育以及遗传上的高度杂合等因素一直严重影 响着柑橘育种工作的开展。基因工程的发展为柑橘的育种工作开辟了一条新的途径， 从而使利用单个基因改造柑橘的品质成为可能。本研究利用章期较短的早实枳作为 转化材料，建立并优化了其高效再生和遗传转化的体系，以期使其成为柑橘基因功 能验证和研究的平台。利用该转化体系和RNA干涉技术，获得了一批与柑橘类胡萝 卜素代谢相关基因的遗传转化材料，并对这些材料进行了分子鉴定和基因表达的初 步分析，本研究主要取得了以下结果： 1．建立了早实枳(Poncirus paradisi Macf．×Creticulata Blanco．)的高效再生及遗传转化体系，对若干影响再生和转化 效率的因素，如外植体的绿化、共培养条件，激素的组合和用量，筛选的方法等进 行了优化。对黄化的早实枳茎段或Cocktail上胚轴进行4．5 d的光照处理，可以显著提 高外植体的再生能力和转化率；共培养过程中，O．4 Lo的2，4．D可显著提高外植 mg 体的转化率，而过高的2，4．D浓度(O．6．0．8L-1)则抑制不定芽的再生，降低转化 mg L-1BA-I-0．1 率。培养基G(MT-I-1 L。NAA)对正常芽的再生最有利，过高 mg mg 的BA浓度(大于1．5L1)虽然能提高芽的数量，但也造成大量畸形芽的出现。实 mg 验中还发现，潮霉素对早实枳茎段的再生有强烈的抑制作用。在早实枳再生试验中， 通过嫁接再生的早实枳有36．4％(8／22)只需要9个月就能开花，而通过生根再生的 (41／47)开花。这表明早实枳早花早果的特性可以经过组织培养和再生过程稳定地 遗传给后代，可以用于柑橘功能基因的研究。 2．构建了BCH基因片段的反义表达载体pCABCH，并用于转化伏令夏橙(c． sinensis 抗性愈伤组织中类胡萝b素含量的变化，结果表明，大部分转化愈伤中叶黄素和0【． 胡萝卜素的含量有所增加。50一60L。1的潮霉素对伏令夏橙愈伤组织的再生影响较 mg 大，强烈抑制再生植株的生长。 柑，得到了23株早实枳再生植株，其中12株PCR检测呈阳性；得到转化山金柑4株。 4．分别以LC阳的基因序列片段，和LCYE基因的5’和3’端片段，构建了 萄柚。Real—timePCR结果表明，在LCYE基因被抑制的的早实枳植株中，PDS基因 基因抑制的植株叶片中，Q一胡萝b素含量的下降，p．胡萝b素的含量和紫黄质的含 量增加，而叶黄素的含量没有显著的变化。但B一胡萝b素和紫黄质的含量却与其基 因的表达水平呈反比!据此我们推测，对LCYE基因的干涉可能通过某种机制激活 了上游PDS基因的活性。而6一胡萝b素和紫黄质的含量增加可能与代谢物质的反馈 调节有关：随着PDS基因表达量增加，上游(．类胡萝b素和番茄红素的含量增加， 导致下游的代谢产物B一胡萝b素和紫黄质的含量显著增加，而这些代谢产物对其本 身的合成基因LCYB和ZEP又产生了反馈抑制作用。 呈下降趋势。同时，p．胡萝b素和下游紫黄质的含量在转基因植株叶片中的含量下 降，0【．胡萝b素和叶黄素的含量没有显著的变化。D．胡萝b素的含量和LCYB基因的 表达量呈正相关，即LCYB基因的表达量越高，叶片中B．胡萝b素的含量也越高。 而这一过程可能会导致番茄红素的积累。 关键词：早实枳；短童期；遗传转化；类胡萝b素代谢相关基因；RNAJ Il ABSTRACT Citrusisoneofthemost fruitsallovertheworldandthefruit is