棉花体细胞胚胎生形态、遗传分析及初始脱分化相关基因的克隆与表达分析.pdf

棉花体细胞胚胎发生形态、遗传分析及初始脱分化相关基因的克隆与表达分析 棉花体细胞胚胎发生形态、遗传分析及初始脱分化 ‘ 相关基因的克隆与表达分析 摘要 棉花不仅是主要的纤维作物，还是重要的油料和蛋白质资源，是世界上主要的 经济作物之一。棉花生产稳定与否，直接关系到整个农业生产、农民收入和纺织工 业的发展。因此，对棉花品种进行不断的改良和创新，培育出更多高产、优质、抗 逆的新品种，成为棉花育种家们不断追求的目标。棉花组织培养是育种研究中的有 效手段，可以通过各种生物技术手段加速育种进程，提高育种效率，创造新的育种 材料，并可为现代分子育种和基因工程研究提供有效的实验技术手段。棉花组织培 养工作起步较晚，而且棉花是被公认的体细胞胚胎发生困难和难于体外遗传操作的 作物之一。因此，研究亚洲棉体细胞胚胎发生、棉花体细胞胚胎发生的起源以及遗 传规律，以及从分子水平揭示棉花细胞脱分化现象等方面的工作，是进一步完善棉 花转基因体系的重要途径。本研究的主要结果如下： 1对四十个亚洲棉品种进行了愈伤诱导，以及后期的分化调控处理，为建立亚洲棉 种常用植物激素组合条件下都容易诱导出愈伤，出愈率均为100％。但在不同激素组 合上的愈伤状态显著不同，继代处理表明NK处理更适合于后期的分化调控处理， 能够获得状态较好的愈伤。此后，通过改变培养方式、培养基组分，以及其他处理 等方式或组合上述处理等方式进行分化调控，使用了近300种培养基，仅在卡宝品 红染色时发现了部分类似于胚性愈伤的细胞，但未获得体细胞胚。 2对YZl进行了不同激素组合条件下的体细胞胚胎发生研究，建立了高效快速的再 生体系；并利用组织切片的方法观察了体细胞胚胎发生的过程，表明不同植物激素 处理条件下的体细胞胚胎发生方式是不同的。YZl在8种植物激素(包括不含植物 激素)处理上均能通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株。但不同处理间的体细胞 胚胎发生能力存在显著差异，IBA+KT处理表现出最高的分化率，可以达到97．6％， 是常用植物激素组合2，4．D+KT处理中分化率28．6％的3倍。同时观察发现，整个 体细胞胚胎发生过程(从外植体接种到体细胞胚的出现)仅为33天，是目前棉花体 细胞胚胎发生耗时最短的报道。YZl也能够在不含植物激素的MSB培养基上也能够 获得分化。此外，组织学观察表明，2，4．D+KT和IBA+KT处理中的体细胞胚胎 发生模式不同，胚性细胞团分别起源于初生形成层和皮层细胞，从一定程度上解释 了IBA+KT处理能够快速促进体细胞胚胎发生的原因。 3通过构建陆海杂种Fl及F2群体，以及8个不同再生能力品种的完全双列杂交，研 究棉花体细胞胚胎发生遗传规律。选择容易再生的陆地棉品种Coker201与再生困难 华中农业人学2009届博士学位论文 的海岛棉品种Pima90杂交获得Fl，利用不同植物激素组合诱导两个亲本和Fl进行 体细胞胚胎发生，Pima90和Fl均不能体细胞胚胎发生；次年自交获得F2种子，F2 个体经过半年多的诱导调控处理未见一个个体分化。随后，对容易再生的陆地棉品 愈伤诱导和分化调控处理，仅有陆地棉之间的两个杂种获得了再生，且其对应的反 交没有获得再生。随后，选择正反交均不能分化的Fl(YZl和EK4杂交获得)进行 自交，获得的F2群体进行体细胞胚胎发生遗传规律分析；仅有YZI作父本的F2群 体中有14个个体获得了胚性愈伤，且胚性愈伤状态各异，胚胎发生能力间也存在显 著差异。表明体细胞胚胎发生能力是一种复杂的遗传性状，可能同时受细胞质和细 胞核内多个基因的互作控制。 4构建细胞脱分化相关基因的SSH文库，对部分相关基因进行了表达分析，并提出 了可能的SAM．dependent转甲基调控细胞脱分化的分子机制，部分相关基因进行了 初步的功能验证。利用来自三种不同激素处理诱导6，12，24，72，168小时的下胚 杂交中的差异表达明显的克隆进行测序，共有286个差异表达的eDNA克隆被测序， 112个独立的EST被分离鉴定，且其中有40．2％的EST是第一次被分离鉴定，可能 为新发现的棉花细胞初始脱分化相关基因。对相关基因的表达分析表明，GST在植 物激素诱导初期的6．24小时内高度表达，腓在不同处理中优势表达并表现出不 同的表达模式，表明它们可能与棉花细胞脱分化关系密切。此外，棉花SAM代谢 析表明，它们的