纳米雄黄抗肿瘤用机理研究.pdfVIP

摘要摘要 摘要摘要 目前 随着雄黄在肿瘤治疗中的应用日益为人们所关注 使得提高其生物利用度 降低毒副作用等问题迫切需要解决 在本研究中 我们考虑对雄黄进行纳米化处理以 提高其生物利用度 分别对纳米雄黄的粉碎 炮制以及固体分散体制备工艺进行了系 统的研究 并以白血病HL-60 细胞为模型 研究了纳米雄黄对肿瘤细胞增殖的影响及 其诱导细胞凋亡作用 同时考察了纳米雄黄对细胞的氧化应激反应 胞内谷胱甘肽氧 化还原水平以及膜毒性 完成的工作包括以下几个方面 1 分别对纳米雄黄的粉碎 炮制以及固体分散体制备工艺进行了系统地研究 400 r/min 6 h 327.4 nm 使用行星式高能球磨机 湿法研磨 研磨 即可得到粒径为 多分散指数为0.312 的纳米雄黄粉 TEM SEM 分析显示该粉体颗粒形状不规则 有 一定程度的团聚 经超声分散可有效消除此团聚现象 对所制纳米雄黄粉分别进行了 酸洗 碱洗 水洗以及水飞处理 干燥方法采取自然干燥或醇洗干燥 结果表明水飞 醇洗干燥工艺可有效去除As O 防止团聚 以As O 含量和均一性为指标 通过正 2 3 2 3 交实验筛选纳米雄黄固体分散体制备工艺 得出最佳工艺条件为 雄黄 PEG=1:5 搅拌时间 30 min 搅拌温度 70 5 并以As2O3 含量和微观形貌为指标考察了纳 米雄黄固体分散剂的化学和物理稳定性 结果表明 在暴露的30 d 内 粒子可保持较 好的化学物理稳定性 2 为了进一步确证纳米生物效应 排除本底 As O 可能的贡献 制备了具有 2 3 相同As O 本底浓度的原料雄黄与纳米雄黄分散体 同时设以As O 本底浓度加药组 2 3 2 3 通过细胞计数及噻唑蓝 MTT 方法研究了三者对HL-60 细胞增殖的影响 同时应用 荧光显微镜 琼脂糖凝胶电泳 流式细胞术及RT-PCR 技术研究其诱导细胞凋亡的作 用 结果表明纳米雄黄可明显抑制细胞生长 降低存活率 诱导细胞凋亡 表现出细 胞体积缩小 细胞核的浓缩以及典型的 DNA ladder 电泳条带和较高的凋亡率 且 细胞周期分析结果表明纳米雄黄主要阻滞细胞生长于G0/G1 期 细胞经rhodamine 123 荧光标记 流式细胞术测定发现 纳米雄黄可显著降低细胞线粒体膜电位 采用 RT-PCR 技术测定了与线粒体介导的凋亡密切相关的 Bcl-2 与 Bax 等相关蛋白基因 II mRNA 水平变化 结果发现纳米雄黄可显著抑制Bcl-2 蛋白基因mRNA 水平 而对 Bax 影响不明显 另外 根据纳米雄黄固体分散体和原料雄黄固体分散体的体外氧化 动力学 PBS 缓冲溶液中 37 5% CO2 结果发现 前者的氧化速率明显高于后者 的 以上结果表明纳米雄黄较原料雄黄表现出明显的细胞生长抑制和凋亡诱导效应 且在此过程中 纳米雄黄可能是通过释放可溶性砷来发挥其细胞毒作用的 3 应用DCFH-DA 荧光标记荧光分光光度法及TBARs DNPH 和DTNB 比色 法分别研究了纳米雄黄对胞内活性氧水平 膜脂质过氧化程度 蛋白质羰基和还原型 巯基含量的影响 结果表明 伴随胞内活性氧水平的提高 纳米雄黄组细胞膜脂质过 氧化程度和蛋白质氧化程度尤其是蛋白质还原型巯基的氧化明显加剧 根据抗氧化酶 活性测定结果发现 纳米雄黄作用细胞36 h 可显著抑制CAT 酶活