耐热乳糖酶的分表达研究.pdfVIP

摘 要 耐热乳糖酶的分泌表达研究 学科、专业：工科、食品科学 入学时间：2008 年 9 月 1 日 硕士研究生姓名：王双辉 答辩时间：2011 年 03 月 11 日 指导教师：陈卫教授 授予学位时间： 摘 要 乳糖酶（EC.3.2.1.23 ），或称 β-半乳糖苷酶（Lactase ），能水解β-1,4-半乳糖苷键。 该酶最重要的用途之一是制备低乳糖奶，可以有效地解决乳糖不耐症的问题，促进乳品 工业的迅速发展。耐热乳糖酶具有常温乳糖酶无法比拟的优越性，如生产周期短、卫生 性好、设备占用率低和能耗低等。由嗜热脂肪芽胞杆菌（Bacillus stearothermophilus ）染 色体基因 bgaB 编码的乳糖酶具有良好的热稳定性，在 70℃仍能保持活性稳定。 对于像耐热乳糖酶 BgaB 这种有巨大应用潜力的酶，常采用分泌方式将酶分泌到发 酵液上清中，这可以大大简化分离纯化工艺，节约成本。然而本实验室先后尝试了青霉 素酰化酶、淀粉酶和中性蛋白酶等信号肽，都未在 B. subtilis 中对BgaB 实现有效分泌。 可能的原因是由于 BgaB 中存在特殊结构阻止了成功分泌，因此本课题将研究 BgaB 结 构对蛋白分泌的影响，通过改变 BgaB 的一级结构来提高该酶的分泌效率。 由于蛋白质的表达是分泌的前提，因此本课题尝试了LipB 、WprA 和 NprE 等多种 信号肽来表达 BgaB 。得到了重组菌株WB600(pMALipB-bgaB) 、WB600(pMAWprA-bgaB) 和 WB600(pMANprE-bgaB) 。实验结果显示，各重组菌耐热乳糖酶 BgaB 表达差异非常 显 著 ， 其 中 WB600(pMANprE-bgaB) 有 较 高 的 表 达 ， 酶 活 可 达 2.091U/mL ， WB600(pMAWprA-bgaB)表达较低，最高酶活仅 0.328 U/mL，而 WB600(pMALipB-bgaB) 无法检测到乳糖酶活性。这表明信号肽对 BgaB 的表达存在较大的影响，有些情况会致 使表达失败。 为了研究疏水性对 BgaB 分泌的影响，本论文通过 PCR 的方法获得了删除部分强疏 水区的 bgaB-X （X=1 、2 、3、4 、5 ）基因，构建了一系列载体pMANprE-bgaB-X，并将 其转入枯草芽孢杆菌 WB600 中，得到了重组菌株WB600 （pMANprE-bgaB-X ），在此基 础上研究了 BgaB 中强疏水区对其分泌的影响。结果表明，BgaB 的 N-端疏水区的切除 能少量提高 BgaB 的分泌量，而其他强疏水区的切除不仅对其分泌没有贡献，反而降低 了BgaB 的分泌效率。 此外，本课题还研究了 BgaB 的长度对其分泌的影响，构建了含不同长度的 bgaB 基因的一系列载体 pMANprE-bgaB-Y （Y=A 、B 、C、D ），并将其转入WB600 中，得到 一系列重组菌 WB600(pMANprE-bgaB-Y) 。研究结果显示，当 BgaB 长度较小时，随着 BgaB 长度的减少，BgaB 的分泌效率有所提高。 关键词：枯草芽孢杆菌；信号肽；分泌表达；乳糖酶；长度；疏水性 I Abstract Expression and Secretion of Thermostable Lactase Subject and Speciality: Engineering, Food Science Time of enrollment: 01-09-2008 Master graduate student: Shuangfei Wang Time of defense: 00-03-2011 Fac