茶树咖啡碱生物成相关酶基因原核多基因表达载体的构建及其体外表达调控.pdfVIP

万方数据 摘 要 咖啡碱 （1,3,7-三甲基黄嘌呤）作为茶叶、咖啡和可可三大软饮料植物中嘌 呤碱的主体成份，一方面因具有多种生理功能而被广泛应用于医药、食品、化工 等领域；另一方面长期过量摄入咖啡碱会对人体产生一定的负面影响，从而使脱 （低）咖啡碱的茶叶产品受到越来越多的欢迎。 目前市场上出售的咖啡碱和低咖啡碱茶产品大都采用化学合成方法制备提 取，这种方法存在附加产物多和污染环境的缺点。而从茶叶和咖啡中提取或除去 天然咖啡碱的方法，则提高了原料和加工成本，容易残留有害物。 因此，利用基因工程，通过构建工程菌，体外生产咖啡碱具有广阔的应用前 景；同时，研究咖啡碱生物合成过程中关键酶基因的生物学功能，可以实现对咖 啡碱生物合成的人工调控，为低咖啡碱茶树分子育种奠定理论基础。 咖啡碱的生物合成路径主要包括四步反应，具体合成路径为：黄嘌呤核苷 (XR)→7-甲基黄嘌呤核苷(7mXR)→7-甲基黄嘌呤(7-MX) →可可碱(3,7-二甲基 黄嘌呤) →咖啡碱(Cf)。 本文通过对参与咖啡碱生物合成的关键酶在大肠杆菌中进行组合表达及其 功能活性分析，尝试建立利用大肠杆菌体外合成咖啡碱的研究平台；同时通过分 析比较找出可能影响茶树咖啡碱合成酶催化活性的关键氨基酸位点，进行定点突 变来调控可可碱和咖啡碱的合成，探索茶树咖啡碱生物合成的分子调控机制，为 人工调控咖啡碱的生物合成提供理论依据。主要研究内容及结果如下： 1. pMAL-CaXMT和pMAL-TCS1表达载体的构建及其体外表达研究 7- (CaXMT) (TCS1) 根据咖啡 黄嘌呤核苷甲基转移酶 和茶树咖啡碱合成酶 基 因的ORF设计两对特异性引物，以RT-PCR扩增获得CaXMT和TCS1基因片段， 分别插入 pMAL-c5X 中，成功构建了重组表达载体 pMAL-CaXMT 和 pMAL-TCS1。对获得的融合蛋白进行体外表达研究，结果验证了CaXMT可以 催化黄嘌呤核苷(XR)生成7-甲基黄嘌呤(7-MX)；TCS1可以催化7-甲基黄嘌呤生 成可可碱(Tb)和咖啡碱(Cf)。 2. 多基因融合表达载体pMAL-CaXMT-TCS1 的构建及其表达研究 将重组质粒pMAL-CaXMT和pMAL-TCS1分别经 SalI/SbfI双酶切后，通过 连接反应成功构建了双基因融合表达载体pMAL-CaXMT-TCS1.分别对表达的融 HPLC LC-MS CaXMT 合蛋白进行体内和体外酶活性分析，产物经 和 检测，表明 和TCS1基因在大肠杆菌中组合表达，可以实现从底物XR到7-MX、可可碱和 咖啡碱的转化。进一步对酶反应条件进行优化，得到最佳酶反应条件是在底物 XR SAM 17 114 μmol/L 25 4h 和 的终浓度分别为 和 条件下， ℃水浴中反应 。 I 万方数据 此时产物中咖啡碱浓度达到最大为43.87μmol/L. 3. 茶树咖啡碱合成酶(TCS1)的定点突变及体外表达研究 通过分析茶树咖啡碱合成酶(TCS1)与可可碱合成酶(ICS1)的蛋白质空间结 构模型，找到了四个可能影响TCS1催化活性的关键位点，分别是TM1：225位