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Page ? * 人体外周血淋巴细胞培养 与染色体核型分析 目 录 实验目的 实验原理 实验材料与试剂 实验方法与实验原理步骤 核型分析结果 实验分析 实验目的 2、了解动物细胞培养的方法。 1、掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本的制备。 3、熟悉人类染色体在镜下检查和核型分析方法。 实验材料与试剂 （一）实验材料： 人体外周血淋巴细胞 （二）实验试剂: 1.培养基：完全RPMI1640培养基 2.秋水仙素：0.4mg/ml 3.低渗溶液：0.075mol/L KCl 4.磷酸缓冲液 pH6.8 5.固定液：Carnoy固定液 6.Giemsa染液 7.PHA:0.15mg/ml 实验原理 染色体是组成细胞核的基本物质, 是基因的载体。 人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。本实验采用了微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。在正常情况下, 人外周血中是没有分裂相的, 只有在异常情况下才能发现。 植物血细胞凝集素(PHA) 是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在 PHA 作用下, 原处于 G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞, 进而进行有丝分裂。 秋水仙素又叫秋水仙碱，它对细胞的作用主要有两个方面： 一是阻挠微管的聚合、破坏纺锤体阻断细胞的有丝分裂 二是使细胞收缩成一定的形状。 实验原理 染色体组型：又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。核型模式图，是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。 染色体组型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、对比分析、配对、分组、排列，对各染色体的形态进行分析。在细胞遗传学、现代分类学、生物进化和遗传育种学等研究中，是重要的研究手段。 实验原理 对于任何一个染色体的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个： （1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100% （2）臂指数=长臂/短臂 （反映着丝粒位置的指数） （3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数） 　　　人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。其中22对是男女共有的染色体，一对为男女所不同的性染色体，男XY,女XX。 人类染色体组型 群组号 染色体号 形态大小 着丝粒 位置 鉴别程度 A 1~3 最大 M 可鉴定 B 4~5 次大 Sm 不易 C 6~12+X 中等 Sm 难鉴定 D 13~15 中等 St 难鉴定 E 16~18 较小 16m,17m和18m 可鉴定 F 19~20 小 M 不易 G 21~22+Y 最小 st 难鉴定 实验方法与步骤 37℃恒温箱 继续培养到72小时 核型分析 培养基：3ml PHA:0.15mg/ml 外周血：0.18ml 69小时后 加秋水仙素 收集细胞 制片，观察 实验方法与步骤 （一）培养液配制 在超静工作台内无菌操作，每个培养瓶中加入3ml培养液后，再加入PHA ，PHA的终浓度为0.15mg／ml，将上述试剂加入培养瓶中后，反复吹打使其混合均匀。每组共配制4瓶。 实验方法与步骤 （二）采血与培养 　　采血与培养：到医院采血2ml常规消毒后，将灭菌小瓶送入超净工作台 ，在火焰旁将血液滴入2个盛有5ml培养液的培养瓶内（男女各一个），每瓶400μml，盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培养瓶放在37℃恒温箱内静置培养72h。（每天摇动培养瓶两次） （三）秋水仙素处理 　向经恒温培养终于培养前6小时的外周血淋巴细胞培养液中加入秋水仙素30μml。 实验方法与步骤 （四）标本的制备 1、终止培养后，将培养物混匀，倒人离心管内，离心沉淀8分钟(1000r/min)，弃去上清液。 2、先加入1ml加入低渗液，轻轻吹打，使细胞重悬，然后在加入37℃预温的低渗液6m1，轻轻打匀，置37℃水浴箱中20分钟。（使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。） 3、低渗处理完毕后，直接加入新配的固定液1 m1进行预固定，混匀后，离心8分钟(1000r/min)。 4、弃去上清液，沿离心管壁缓慢加入固定液6m1，轻轻吹打混匀，置室温20分钟。离心沉淀1000 r/min，8分钟。 5、重复第4步。 6、尽量吸净上清液，视管底剩下的细胞多少加入适量固定液(0.3～0.6m1)，轻轻吹打成细胞悬液。 7、滴片：取保存在冰水中的冷湿载玻片张，稍倾斜，用滴管吸取细胞悬液，从0.6m高处滴2滴于玻片上，立即用口对准玻片吹气，使细胞在玻片上散开，然后在烘箱略烘一下。 实验方法与步骤 （五）染色： 1、把滴好的在载玻片放入染缸中，将稀