RNAi转基因植物针对DNA的快速精确检测方法分析研究.pdfVIP

摘 要 RNAi技术在转基因植物上的应用越来越广，包括已经允许商业化生产的转基因植物中，但 目前对RNAi转基因植物的快速精确检测技术相对滞后。本研究的目的在于建立基于DNA的 RNAi转基因植物快速精确的检测体系，实现对RNAi转基因植物的有效检测，弥补现有转基因 检测技术的不足。检测体系的建立主要基于探针的制备、多重PCR、全基因组扩增、基因芯片杂 交技术及PCR产物的变复性电泳等几个方面。 关于探针的制备，首先通过查阅大量文献搜集并整理了RNAi转基因事件中常用转基因元件 37个，包括启动子14个，终止予4个，选择标记基因5个，报告基因2个和内含子12个。根据 上述转基因元件的保守序列设计引物，PCR扩增获得点制芯片的探针。同时设置阳性、阴性和空 rDNA， 白对照用于后期：签片杂交实验的质量监控。其中阳性对照为真核生物中普遍存在的18S 阴性对照为野猪肝脏中表达的一个基因，空白对照为不含任何核酸的点样液。探针经PCR方法 扩增获得，扩增产物纯化定量后用于点制基因芯片。 本研究搜集了8种植物样品作为检测对象，包括4种RNAi转基因水稻，2种普通转基因植 物，1种转空载体的对照转基因水稻，1种野生型水稻。提取上述样品的基因组DNA，取一部分 样品进行多重PCR扩增，扩增产物与芯片杂交；另一部分样品进行全基因组扩增，获得足够杂 交的样品并经片段化处理后与芯片杂交。 本研究优化了多重PCR体系及基因组片段化体系，获得了适用于芯片杂交的样品。开展了 组样品与芯片杂交实验。两种样品处理方式的杂交结果显示：多重PCR样品与芯片杂交后检测 到强烈的转基因元件的信号，基因组样品与芯片杂交检测到阳性对照、水稻基因组元件及转基因 元件的信号。芯片杂交实验取得成功，其结果可用于下一步实验。但结果中存在一些假阳性，因 此芯片杂交实验有待进一步完善。 本研究以样品OsCtBPA为例，根据两次芯片杂交实验中检测到的启动子和终止子设计引物， 扩增转基因目的片段，根据RNAi结构的特点，利用变复性电泳实验进行了检测验证。结果表明， 扩增得到的RNAi转基因目的片段，变复性后条带位置的确发生了变化，而转空载体的对照则没 有，说明变复性电泳实验是可行的。本研究下一步将对其它样品进行检测。 本研究经过对探针制备、样品准备、芯片点制、芯片杂交和变复性电泳等实验体系的摸索和 优化，初步建立了依据DNA来检测鉴定是否为RNAi转基因植物的技术体系，可以用于对RNAi 转基因植物进行检测，对RNAi转基因植物的规范管理具有十分重要的意义。 关键词：RNAi，转基因检测，基因芯片，多重PCR Hl Abstract those RNAi is usedin allowed technologyincreasinglywidely transgenicplants，including commercial the andaccuratedetectionmethodsforRNAi are production．Butrapid transgenicplants for ofthis istoestablisha behindthosecommon relativelylag transgenicplants．Thepurpose study forRNAi basedonDNA call andaccuratedetectionmethod transgenicplants technology,which rapid