三DNA与RNA分析方法.pptVIP

第三章 DNA与RNA分析方法—电泳 电泳是分离、鉴定和纯化DNA与RNA片段的标准方法，该方法操作简便、快速，可分辨其他方法 如密度梯度离心、纤维素柱等分离方法 无法分离的DNA或RNA片段。将低浓度的荧光 嵌入染料染色后可直接确定DNA或RNA在凝胶 中的位置。检测的量可少至1-10ng。并可从凝胶中回收DNA条带，用于基因的克隆等操作。 根据凝胶介质的不同可分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 第一节 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的线状高聚物，经过纯化后可作为分离DNA或RNA的介质。琼脂糖经某些化学修饰后可变为低熔点琼脂糖，其熔点和凝固点降低，但凝固后凝胶的强度无明显改变。琼脂糖的基本结构： 琼脂糖凝胶分离DNA片段的原理 琼脂糖吸水形成胶球，不同大小的DNA分子通过胶球之间的孔隙时移动的速度不同，DNA分子越小移动的速度越快，DNA分子越大移动的速度越慢。 一、普通琼脂糖凝胶电泳 目的：检测、分离和纯化DNA或RNA片段（0.5-25 kb） 1. 凝胶浓度与待分离DNA大小的关系 琼脂糖浓度（%） 线性DNA的有效分离范围（kb） 0.5 30 - 1 0.7 12 - 0.8 1.0 10 - 0.5 1.2 7 - 0.4 1.5 3 - 0.2 2.0 2 - 0.1 2. 琼脂糖凝胶的制备 1 配胶：按一定的比例加入琼脂糖和电泳缓冲液 常见的电泳缓冲液。 缓冲液 使用浓度 储存液 TAE pH 7.5 – 8.0） 1 x : 40 mM Tris-乙酸 50 x : 242 g Tris 1 mM EDTA 57.1 g 冰乙酸 100 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 TPE pH 7.5 – 8.0 1 x : 90 mM Tris-磷酸 10 x : 108 g Tris 碱 2 mM EDTA 15.5 ml 85% 磷酸 40 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 TBE pH 8.3 0.5 x : 45 mM Tris-硼酸 5 x : 54 g Tris 碱 1 mM EDTA 27.5 g 硼酸 20 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 2）煮胶： * 注意要使琼脂糖充分胶化 3）倒胶： * 注意要将固定框封闭好，防止漏胶 琼脂糖凝胶的制备过程 3. 凝胶电泳 在电泳槽中加入电泳缓冲液至胶面上3-5mm，将DNA样品加入到凝胶的梳孔中，先在较高电场下电泳5min，然后在正常电场下电泳。一般琼脂糖凝胶电泳时加在胶上的电压不超过5V/cm。 在低电压时，线状DAN片段的迁移速率与所加的电压成正比，但随着电场强度的增加，高分子量DNA片段的迁移率以不同的幅度增长。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。 影响凝胶DNA电泳的因素 1）琼脂糖的浓度 2）DNA的构象：分子量相同的超螺旋环状（I型）、 带切口环状（II型）和线状（III型）DNA在凝胶 中的运动速度不一样。它与凝胶的琼脂糖浓度、 电流强度、缓冲液离子强度和DNA超螺旋度有关 3）电场方向： 电场方向不变时，较长的DNA分子（50-100kb）在琼脂糖凝胶上的迁移速率相同。但如果周期性的改变电场的方向，DNA的分辨率将发生改变。 4）碱基组成与温度： DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为与碱基组成和电泳温度变化关系不大，不同大小的DNA片段在4 oC —30 oC相对迁移率不变。 5）嵌入染料： 溴化乙锭堆积在DNA碱基之间，能拉长线状和带切口DNA，使线状DNA的迁移率降低15%。 6）电泳缓冲液的组成： 离子强度低，迁移率低。离子强度高，迁移率高，但会引起凝胶发热。 4. DNA的检测 琼脂糖经溴化乙锭染色后在紫外灯下进行检测 DNA分子量的测定 常用标准分子量： λDNA（48.5 kb）, pBR322 4.36 kb λDNA-EcoR I: 21226, 7421, 5804, 5643,4878, 3530 bp λDNA-Hind III: 23130, 9416, 6557,4361, 2322, 2027,564, 125 λDNA-EcoR I- Hind III: 21226,5148, 4973, 4268, 3530, 2027, 1904, 1584, 1375, 947, 831, 564,125 pBR322 DNA-Hae III: 587, 540, 504, 458, 434, 267,234,213,192,184,124,123,104,89,80,64,57, 51,21,18,11,8 DNA分子量的测定 方法一：