基因修饰的鸡新城疫病毒F48E9株HN基因DNA疫苗的构建及其免疫效力评价.pdfVIP

获奖论文 基因修饰的鸡新城疫病毒F48E9株HN基因 DNA疫苗的构建及其免疫效力评价 贺 笋1山 王云峰h 木古丽1’2 石星明1 王玫1 童光志1 (1．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001； 2．新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052) 摘要：DNA疫苗的免疫效果与抗原基因的表达量和免疫原性有直接关系，为了提高目的基因的表达量，增强其免疫 效果，本研究对NDVF船马株的HN基因进行了修饰，将NDV氏马株的HN基因的密码子全部替换为鸡体内偏嗜性密码 子，同时在删基因的5’端加上同样已替换密码子的禽流感病毒HA蛋白信号肽序列。修饰后删基因命名为SOptiHN，剔 的HN蛋白。结果显示。与未经修饰的HN基因相比。修饰后的HN基因体外瞬时表达水平明显提高，并且密码子优化与添 免疫，二免后以l护ⅡD。NDV的F舶马强毒株进行攻毒，计算发病率、死亡率、以及排毒情况。免疫前后，及攻毒前后每周采 集血清和外周血淋巴计算Ⅲ抗体和细胞因子IFN一7和IIJ—18动态变化情况。分析结果表明，相比NDVF艟E9株的HN基 因而言，修饰后的I-IN基因可以诱导更加强烈的免疫反应，产生更好的保护效率。 关键词：NDV；DNA疫苗；密码子优化；信号肽；免疫印迹 引 言 disease 新城疫病毒(Newcastlevirus，NDV)属于副黏病毒科腮腺炎病毒属，是一种高致病性病毒。对禽 类危害较大，是世界公认的两大重要禽病之一。新城疫于1926年首次暴发于印度尼西亚爪哇和英国新 城，在此之前，中欧亦有类似报道。本病的死亡率极高，强毒力毒株可以引起的感染常达100％，已经遍 布世界各地。目前，防控新城疫的有效方法仍是疫苗接种，其中应用最为广泛的是新城疫弱毒活疫苗，但 弱毒疫苗和强毒一样也能导致潜伏感染，疫苗免疫不能阻止继发的强毒感染，免疫鸡常成为潜在的传染 源，而灭活苗又存在免疫效果差、成本高等缺点，同时这些疫苗的使用还会影响NDV疫情的监测b1。因此 采用传统的方法很难控制和消灭该病，迫切的需要一种新型的防控手段。 蛋白位于病毒囊膜表面，与病毒的毒力及致病性密切相关，能够特异地与红细胞表面唾液酸受体结合，因 此在病毒的感染中起重要的作用，可以作为研制亚单位疫苗、活载体疫苗和DNA疫苗的候选抗原。 由于核酸疫苗可诱导机体产生全面的免疫应答，并且对不同亚型的病原体具有交叉防御作用，同时 兼备安全、可靠、生产方便等优点，故被认为是继减毒活疫苗、灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗之后的第 ·作者简介：贺笋(1980一)，男，汉族，新疆阿拉尔市人，新疆农业大学在读硕士研究生，主要从事禽类基因工程疫苗的研究与开发。 ··通讯作者：E—mailI yhaag@hvn．∽．cn；gztong@hwi．∞．∞。 12 2007学术年会 三代疫苗。但是，DNA疫苗也存在其自身的局限性，目的基因的免疫原性较弱以及其蛋白表达水平不高 严重制约了它的发展。有相当多的文献报道，免疫原基因的修饰可以显著的改善蛋白的表达效率，为了 探索解决这一问题的新途径，提高HN基因的表达量从而增强其免疫原性，本研究将HN基因的密码子全 部替换为鸡体内偏嗜性密码子，并在I-IN基因的5’端加上也替换了密码子的禽流感病毒HA蛋白信号肽 序列，通过体外表达实验和动物实验对修饰的I-IN基因产生的效果进行了评估。 1材料和方法 1．1 材料 1．1．1质粒、细菌与细胞 适刺激序列，由三个连续的“TW,CTr”序列构成，全链硫代磷酸化，插入NheI和鳓I酶切位点之间； DH5a宿主菌和293T细胞由本实验室保存。 1．1．2生化试剂、免疫学试剂、分子生物学试剂和细胞培养基 限制性内切酶EcoRI、BandtI、跏I和胁以III、DNA分子质量标准(DL2000、DL15000)、DNA快速 Purification DNA聚合酶等均为宝生物工程(大连)有限公司产品；WizardPlasmid质 连接试剂盒、高保真Taq DMEM和灭活过滤除菌的胎牛血清购自GIBCO