生物化学常用技术..pptVIP

第二十二章 常用分子生物学技术的原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application 第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization Blotting Technology 第 二 节 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction 三、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 第 三 节 核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis Sequence Master Fred Sanger, 1958 Was originally a protein chemist Made his first mark in sequencing proteins Made his second mark in sequencing RNA 1980 dideoxy sequencing Sanger Method Sequencing Gel SCHEMATIC OF A TRADITIONAL SEQUENCING GELAUTORADIOGRAM SCHEMATIC OF HOW A DYE-DEOXY GEL MIGHT LOOK IF PRODUCTS RUN ON DIFFERENT TRACKS 基 因 文 库Gene Library 疾病相关基因的克隆与鉴定Cloning and Identification of Disease Relative Genes （三）非定位候选基因克隆策略 由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。 第 六 节遗传修饰动物模型的建立及应用 核转移技术 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。 四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用 建立动物模型 ① 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation) ② 多基因决定疾病模型 g b a A deoxyNTP 1 2 3 4 5 g b a A di-deoxyNTP 1 2 3 4 5 目 录 三、DNA自动测序 采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。 A C G T SEQUENCE IS READ FROM BOTTOM TO GIVE 5’ ACGCTAGGGCTCAA 3’ A C G T COMBINED REACTIONS COMBINED REACTIONS FLUORESCENCE DETECTOR ACTIVATION LASER DNA自动测序结果举例 目 录 1970年测12000个碱基需一年获更多的时间。1987年测序12000个碱基仅需20分钟。今天协作组每秒产出“草图”中的12000个碱基。 1990年，人类基因组计划刚开始时，每个碱基测序至少要花10美元。随着测序过程的改进，自动快速的读取序列，已将测序成本降至每碱基10美分左右。 意义： DNA测序法的建立，表明了人类也可以像细胞一样去读取细胞的信息，也从此打开了通往确定全部遗传学指令的大门，为解析任何生物的全部遗传密码也就是基因组序列开辟了道路。 第 四 节 基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library) 基因文库 (gene library) 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 基因组DNA文库 目 录 第一轮筛选 第二轮筛选 第三轮筛选 基因组文库筛选结果举例 第 五 节 克隆疾病相关基因的策略 （一）功能性克隆(functional cloning) （二）定位克隆(positional cloning) （三）非定位候选基因克隆策略(position- independent candidate gene approaches) （四）定位候选基因克隆策略(positional candidate ge