PCR技术总论..ppt

PCR product PCR反应曲线 标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素 引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium） 引物 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 引物设计的原则（一） ①引物长度： 15-30bp，常用为20mer左右 引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性 ②引物扩增跨度：以500bp为宜 特定条件下可扩增长至10kb的片段 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 引物设计的原则（二） ④避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带 ⑤引物 3’端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处 引物设计的原则（三） ⑦引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 ⑧引物量： 每条引物的浓度0.1 ~ 1umol或10 ~ 100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好 引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 引物设计的原则（四） RT-PCR 引物设计特别注意： 跨越两个外显子 酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100 ul时） 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少 dNTP 的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系 dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低 模板（靶基因，target gene） 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一 传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本 SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀 蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸 模板（靶基因，target gene） 提取的核酸即可作为模板用于PCR反应 一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增 RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 PCR反应条件的选择 PCR反应条件: 温度 时间 循环次数 温度与时间的设置： 设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三