产纤溶酶菌株的分子鉴定及其液体产酶特点分析.pdfVIP

维普资讯 第26卷 第5期 河 南 科 学 V01．26 No．5 2008年 5月 HENAN SCIENCE Mav2008 文章编号：1004—3918(2008)05—0549—05 产纤溶酶菌株的分子鉴定及其液体产酶特点分析 周伏忠-，z， 贾蕴莉z， 陈国参L， 陈晓飞 ， 杜 迅 L (1．河南省微生物工程重点实验室，郑州 450008； 2．河南省科学院 生物研究所有限责任公司，郑州 450008) 摘 要：通过对实验室分离筛选出的2株产纤溶酶能力较强的细菌菌株进行 16SrRNA碱基序列测定，并与已发表 的16SrRNA序列进行对比分析，确定2个菌株均属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)．在此基础上，对2个菌株液 体发酵产纤溶酶的特点进行了对比分析 ．实验结果表明，2个菌株适宜的发酵产酶时间均为60～108h．在优化的 液体发酵条件下，2个菌株单位发酵液中纤溶酶平均产量可分别达到773．07U／mL(菌株 1)和962．28U／mL(菌株2)． 关键词：纤溶酶；枯草芽孢杆菌；液体发酵；16SrRNA鉴定 中图分类号：O939．9 文献标识码：A 自1987年 日本学者须见洋行等首先发现微生物纤溶酶 (fibrinolyticenzyme)具有纤溶活性 以来-【，，微生 物纤溶酶以其具有的无毒副作用、体内半衰期长、成本低廉等其他溶栓剂所不具备的特点，受到各国科学家 的广泛关注和深入研究．现己证明，微生物纤溶酶极有可能成为一种预防血栓栓塞类疾病的优 良保健食品 和药物．目前，国际上多采用通过改 良菌种和优化发酵参数、生产工艺等方法来提高微生物纤溶酶活性 ． 国内微生物纤溶酶的研究主要是菌株筛选和发酵条件研究等，目前还没有微生物纤溶酶产品上市，主要原 因是微生物纤溶酶单位发酵液 中的酶产量低2【7J．作者 自2004年开始进行微生物纤溶酶的菌株筛选、诱变 和发酵条件的实验研究，使微生物纤溶酶从最初的175U／mL提高到现在的310U／mLtS~．为了更有效地提高 液体发酵微生物纤溶酶的单位产量，作者在对分离的2个菌株进行 16SrRNA分子鉴定基础上，购置 了lOL 自控发酵罐，开展了微生物纤溶酶发酵罐发酵产酶条件的实验，以期为微生物纤溶酶的产业化开发乃至微 生物纤溶酶高效表达基因工程菌的构建打下坚实的基础． 1 实验材料 1．1 菌种 1．1．1 纤溶酶产生菌 菌种 1由农家 自制豆豉中分离筛选；菌种2由发酵豆制品中分离．二者均采用LB平 板分离单菌落，然后分别点种于纤维蛋白平板上，通过对比，选取溶解圈面积最大的菌落进行划线、纯化和 培养，斜面保存备用． 1．1．2 鉴定用大肠杆菌 DH5a感受态细胞购 自北京天根生化科技有限公司． 1．2 试剂 胰蛋 白胨 1和酵母浸出物是 OXOID产品；牛纤维蛋 白原 (批号：140607—200535，72mg／瓶)、凝血酶 (批 号：140605—200424，190BP／支)和尿激酶标准品(批号：140604—200632，1280U／支)购于中国药品生物制品 检定所；豆粕和麸皮为市售．细菌基因组DNA提取试剂盒与DNA凝胶纯化试剂盒购于AXYGEN公司；细 菌 16sRNA基因PCR扩增通用引物合成和DNA测序 由上海生工生物工程技术服务公司完成；TaqDNA聚 合酶购于北京金顶公司；dNTPs购于北京科昊泽生物技术有限公司；pGM-T连接载体、D2000(100～2000bp) DNA ／／larker，IPTG和 X—gal购于北京天根生化科技有限公司；T4DNA连接酶、抗生素 (Amp)购于TaKaRa 公司 (宝生物工程 (大连)有限公司)；限制性内切酶EcoRI购于Promega公司；其他试剂均为国产分析纯； 黄豆面和玉米淀粉为市售． 1．3 培养基 1．3．1种子培养基 (LB) pH7．01各配料质量浓度分别为：胰蛋白胨 1％，酵母浸出物0．5％，NaC11％． 收稿 日期：2007—10—16 · 基金项 目：河南省省属科研单位社会公益项 目(o641180203) 作者简介：周伏忠 (1965一)，男，河南浚县人，副研究员，硕士，研