四种细菌多重PCR快速诊断方法的建立和运用.docVIP

项目编号 西北农林科技大学 大学生创新创业训练计划项目 创新训练项目申请书 项目?????? 国家级????????? 项目名称项目负责人??????????????? 学院、年级、专业??? 联系电话???????????? 电子邮件???????????? 填表日????? 2012年3月31日?????? 西北农林科技大学教务处制表 四种细菌多重PCR快速诊断方法的建立与运用对多重PCR各反应条件进行优化取4种细菌的标准株作为阳性对照，用巴氏杆菌作为阴性对照 将测定浓度沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌标准株的DNA进行10倍倍比稀释后混合，进行扩增，测定多重PCR敏感性应用优化好的多重PCR方法分别对阳性菌株，人工感染过的水，牛奶，小鼠以及阳性病料进行检测验证本项目建立的多重PCR方法的可行性二、立论依据 1.项目的研究意义（限200字） 目前，由于猪场饲养环境污染严重，细菌血清型众多、疫苗交叉保护能力差，致使副猪嗜血杆菌病、沙门氏菌病、猪链球菌病、猪多杀性巴氏杆菌病、大肠杆菌病等细菌性疾病发病率升高，难于控制，经济损失严重。沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及链球菌是猪群细菌性疾病的常见病原。我国对致病菌的检验大多沿用细菌培养及鉴定方法，检验步骤繁琐，周期较长。因此，建立快速敏感特异的检测方法对于猪群细菌性疾病的防治意义重大。 2.国内外研究现状分析并附主要参考文献（限1000字） 目前，国内外对临床标本中病原菌的检验大多采用培养法，即采集标本后，先将其接种于增菌培养液进行增菌，待出现阳性结果后，再分离单个菌落，通过形态学、生理学、生物化学、免疫学等方法最终确诊。传统培养方法尽管较为准确，但都需要将病原菌从病料中分离纯化出来，才能作进一步的鉴定，难以满足临床需求。 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction．PCR)技术能弥补微生物学培养和生化方法进行细菌分离鉴定的局限性，是一种新的分子水平细菌分类和鉴定方法，在医学和兽医学临床诊断中有很广阔的前景。多重PCR(Multiplex PCR)技术因具有高效快捷、特异敏感、实验成本低等优点而得到广泛应用。1988年，Chamberlain等首先使用多重PCR技术对人的杜氏营养不良症(DMD)进行检测；随后，多重PCR技术在动物疫病检测方面得到了广泛的应用和发展。国外，QIAGEN公司研制出适于多重PCR反应的新型缓冲系统，已经研制出多重PCR试剂盒，可以直接用于相关基因的检测分析。 国内在运用该技术进行病原鉴定，临床诊断方面也做了一些较有意义的工作。2007年，覃芳芸等设计了3对引物，分别扩增链球菌属特异性gdh、猪链球菌种特异性16S rRNA和猪链球菌2型特异性cps2J等基因。研究结果表明，该方法特异性高、敏感性强，可广泛应用于猪链球菌病的快速诊断及流行病学调查。马保臣等（2006）建立的检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌4种乳腺炎主要致病菌的多重PCR方法与传统细菌学培养法相比，对金黄色葡萄球菌和酵母真菌具有更高的检出率。沙门氏菌和大肠杆菌0157都是目前世界公认引起食源性疾病的重要致病菌。2008年，杨小鹃等针对沙门氏菌、大肠杆菌建立的多重PCR方法可简便、快速、灵敏地实现对沙门氏菌和大肠杆菌0157的同时检测，为食源性致病菌的检测提供了理想手段，有良好的应用前景。 与常规PCR相比，多重PCR不但保持了高度的特异性和敏感性，而且更加方便、快捷和经济，一次反应可检测多个基因，减轻了工作量，尤其是在检测病原体的多重感染、流行病学调查、病原体的分型鉴定等方面具有常规PCR无可比拟的优越性。很多单一的PCR已经被组合为多重PCR应用于实践，一些科研单位也已研制出多重PCR的标准诊断试剂盒。随着分子生物学的发展，很多病原体特异性保守基因序列将被获得，多重PCR技术将会有更加广阔的应用前景。 参考文献： [1] Francois J P，Danbing K。Dominique K B．et a1．Use of tuf Sequences for Genus Specific PCR Detection and Phylogenetic Analysis of 28 Streptococcal Species [J]．Journal of clinical Microbiology ，2004.42(8)：3686-3695． [2] Brasher C W，A DePaola，D D Jones，et a1．Detection of microbial pathogens in shellfish with multiplex PCR [J] Curt Microbiol，