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摘要 关键词 碱性蛋白酶 酶活测定 菌筛选 1 引言 2 文献综述 2.1 碱性蛋白酶概述 2.1.1概述 2.1.2碱性蛋白酶的性质 2.2 产碱性蛋白酶菌的概述 2.3　微生物碱性蛋白酶应用与研究现状 2.3.1国外研究 2.3.2国内研究 2.4 酶活测定原理 2.5 本文研究内容 3 材料与方法 3.1 材料 3.2 实验方法 1、引言 碱性蛋白酶(Alkaline Protease ) 是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,是一类非常重要的工业用酶,广泛存在于动、植物及微生物生物体中,在猪的胰脏中最早被发现。1945年瑞士Dr Jaag等人在地衣芽孢杆菌(B acillus li??cheniform is) 中发现了碱性蛋白酶。有数据显示, 全世界工业用酶每年销售额大约为1亿美元, 在所有的工业用酶制剂中75% 是蛋白水解酶,而蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类, 大约占全世界每年总销售量的60% 左右 。碱性蛋白酶作为工业催化剂已广泛应用于制革、银回收、医药、食品加工、饲料、化学工业、废物处理等行业, 尤其是作为无磷洗衣粉的添加剂应用广泛。但洗涤剂用碱性蛋白酶要求其在广泛的pH和温度范围内保持较高的酶活力和稳定性, 同时还必须与含有多种氧化剂、鳌合剂和表面活性剂的洗衣粉相融合。而目前, 在工业应用中的很多碱性蛋白酶存在弊端, 例如在表面活性剂、氧化剂、热稳定性、酸碱稳定性方面及培养基成本较高等。因此, 寻找一种能分泌具有良好酶学特性并适用大规模工业生产的碱性蛋白酶高产菌种, 具有重要的理论意义和应用价值。而且由于微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速, 具有动植物蛋白酶所具有的全部特性, 同时易于实现工业化大批量生产，产生可观经济效益。并且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力, 有较大耐热性, 有一定的酯酶活力。因此, 筛选能产生碱性蛋白酶的微生物菌株的和研究碱性蛋白酶的酶学性质一直是蛋白酶研究热点。 2 文献综述 2.1 碱性蛋白酶概述 蛋白酶（protease），水解蛋白质肽键的一类酶的总称,占酶制剂市场的65%以上[1]，广泛用于洗涤剂、制革、银回收、医药、食品加工、饲料、化学工业、废物处理等行业。蛋白酶执行大量的不同的生理功能，从细胞水平扩展到器官和有机体水平，导致比如止血和发炎等的级联系统。它们负责包括在正常生理功能和在非正常状态下的病理生理功能的复杂过程。它们也存在于致病生物体的生活史中，这就使它们成为一个潜在的发展治疗因子的对象，来治愈如癌症和艾滋病等可怕疾病蛋白酶应用于食品和清洁剂工业具有悠久的历史。在皮革工业中用于脱毛和皮革软化，来替代以往有毒化学药剂的使用还是一个相对较新的领域，这同时也增加了它的生物化学方面的重要性[]。蛋白酶的多样性以及它们特定的功能已经引起了世界范围内对开发它们的生理学和生物工程的的广泛关注。微生物来源的蛋白酶，由于具有培养简便，产量丰富等特点，适于工业化生产而得以广泛应用。近三十年来，人们对微生物蛋白酶的研究越来越深入，高产工程菌的选育以及对蛋白酶的纯化、结构和性质研究又为大规模工业化生产及应用提供了坚实的基础[]。随着生物化学分子生物学、基因工程、蛋白质工程的兴起，蛋白酶的研究和应用进入了一个崭新的阶段18-35Kda，少数碱性蛋白酶的分子量例外，达到45Kda或82Kda，也有少数蛋白酶分子量很小，有的甚至只有8Kda[5]。在一些芽孢杆菌中，碱性蛋白酶的电泳条带呈现出多样性。这种多样性一方面是由于酶蛋白分子中天冬酰胺或谷氨酰胺残基可逆的脱氨基作用造成，另一方面是因为一些蛋白酶也存在自我剪切作用。 最佳pH及温度 大部分碱性蛋白酶的最适pH值为9~11，如Bacillus sp.所产碱性蛋白酶最适pH值为10~11，少数蛋白酶最适pH值可达到更高。碱性蛋白酶的最适温度分布范围较广，分离自嗜碱芽孢杆Bacillus sp B18的蛋白酶最适温度达到85℃。史劲松等从冰川中分离出一株耐冷菌Bacillus cereus SYP-A2-3，所产冷适性蛋白酶最适温度为42℃； 金属离子对酶活性的影响 二价金属离子如Ca2＋，Mg2＋，Mn2＋等能提高碱性蛋白酶活力，此外Ca2＋能增强绝大多数蛋白酶的热稳定性。研究认为Ca2＋可以保护这些酶热变性并且在高温情况下保护其防止构象改变。另外，特定的Ca2＋结合位点还影响到蛋白酶的活性及稳定性。在一些研究中，发现Hg2＋会阻遏酶活，重金属离子对酶的毒性作用在其他一些文献中也有所论述。大部分二价金属离子对酶活有促进作用