牛乳β-乳球蛋过敏原表位串联体的表达.pdfVIP

摘要 摘要 牛乳过敏是一种常见的食物过敏反应，其中B．乳球蛋白是公认的主要乳过 敏原之一，大约82％的牛乳过敏患者对9．乳球蛋白过敏。另外，表位是引发食 物过敏的物质基础，对食物过敏原表位的探索是食物过敏研究的重要组成部分。 因此，开展牛乳B．乳球蛋白表位的研究具有重要意义。此外，本研究将p．乳球 蛋白表位构建成表位串联体，优化组合的串联体将具有独立的抗原性，在基于 食物过敏原表位检测的研发中具有潜在的应用价值。 本论文工作研究内容包括牛乳B．乳球蛋白线性表位串联体的分子设计，表 位串联体在原核系统中的表达及纯化，抗表位串联体多克隆抗体的制备及表位 串联体的抗原性和过敏原性评估。研究的主要方法、结果及结论如下： 1．以牛乳B．乳球蛋白与人血清I班结合的7个B细胞线性表位(B1，B2， 选合适的组合方式，使构建的串联体中各表位具有独立的抗原性。B细胞表位之 间的间隔序列为甘氨酸(G)，T细胞与B细胞表位之间的间隔序列是两个赖氨 酸 (KK)。最后设计出的串联体分子组合结构为： T-K-K—B I-G-B6-G-B5-G-B3-G—B7-G-B2-G-B4。 2．在设计好的串联体分子两端分别加上酶切位点BamHI和EcoRI后进行基 因合成，合成的基因克隆到载体pMDl9．T中。经过双酶切、连接、转化等步骤， E．coliBL21(DE3)pLysS中。 3．构建好的载体经IPTG诱导表达，表达出的蛋白为串联体融合蛋白，分子 通过对诱导温度、时间及IPTG浓度的优化，得到目的蛋白可溶性表达的最佳条 后其蛋白浓度为4mg／ml。 4．以纯化的串联体融合蛋白为抗原，按常规的免疫程序对两只日本大白耳 兔进行免疫，间接ELISA检测结果表明，纯化的串联体蛋白具有良好的抗原性， 日本大白耳兔对其具有很好的免疫应答。得到的抗体效价分别1：128，000和1： 64，000。通过间接ELISA及免疫印迹实验，结果表明本实验纯化的串联体蛋白与 摘要 牛乳B．乳球蛋白存在较强的免疫交叉反应。 5．用牛乳过敏患者血清检测串联体融合蛋白的过敏原性，结果显示串联体 融合蛋白具有一定的过敏原性。 关键词：D-乳球蛋白；表位串联体；表达：牛乳过敏 H ABSTRACT ABSTRACT Milk infood is common adverse themilk allergyvery reaction．Among wellknown硒aonetowhich milk allergens，p-Lactoglobulin(p—l蓟ismajor 82％of aresensitive．Sinceisthematerialbaseof in allergypeople epitope immunoreaction food on isall issueonfood epitopesimportant allergy,investigation allergy．Therefore， itisof valueto on great 13-1actoglobulin．Besides，in0111work，a investigateepitopes tandemof was constr