布鲁氏菌pcr测方法的应用与分子分型研究.pdfVIP

布鲁氏菌PCR检测方法的应用与分子分型研究 摘 要 为弥补微生物学和血清学方法在布鲁氏菌检测中的不足，以及探索、建立一种快 速、准确的布鲁氏菌基因分型方法，本研究开展了以下三个方面的研究： 首先，通过对已发表的布鲁氏菌属、种、型基因序列进行分析，寻找出布鲁氏菌 种、型特异性基因分布规律，设计引物，运用VirB8-PCR，AMOS-PCR，B1-PCR 方法 对布鲁氏菌属、种、型进行鉴定。与此同时，依据聚合酶链反应- 单链构象多态性 （PCR-SSCP ）原理，建立Ery-PCR-SSCP 方法，用于牛种A19 疫苗株与野毒株的区分 鉴定。 其次，以布鲁氏菌致病力因子VirB7 下游至VirB9 上游基因序列为目的扩增片段， 设计上、下游引物，优化血样、奶样中布鲁氏菌基因组DNA 的提取方法，建立布鲁氏 菌内参 PCR （IR-PCR）检测方法，用于血液、奶液样本中布鲁氏菌的检测，以达到降 低普通PCR 法在诊断布鲁氏菌中的假阴性率。 最后，对本实验室前期研制的布鲁氏菌VirB8基因PCR试剂盒进行组装，并对试剂 盒各项特性（特异性、敏感性、保存期、可重复性）进行评测。同时应用该试剂盒对新 疆、山西的2批65份血样进行了检测，评估该试剂盒的临床稳定性。 通过试验研究，获得以下结果：1.VirB8-PCR，AMOS-PCR，B1-PCR方法能准确检 测出布鲁氏菌，并能对其种、型进行鉴定；PCR-SSCP方法可将A19疫苗株与野毒株区分 开来。2. 内参PCR方法在与细菌分离鉴定、血清学诊断的对比中，呈现出较高的阳性符 合率（与细菌分离的阳性符合率为100%，与iELISA的阳性符合率为62.5% ），其对血样、 奶样的检出量分别为35CFU/ml、350CFU/ml，该方法适合于血样、奶样中布鲁氏菌的检 测。3.VirB8-PCR诊断试剂盒在对布鲁氏菌标准株、疫苗株及65份送检血样进行检测中， 能从SAT阴性血样中检测出2份阳性，表现其敏感性高于SAT，同时实验数据表明，当每 毫升血样中含有布鲁氏菌数量为35时即可被本试剂盒检测出阳性结果，体现出本试剂盒 较高的敏感性。实验结果证实：本试剂盒的可重复性良好、特异性高，-20 ℃下可有效 保存至少6个月。 关键词：布鲁氏菌；PCR；聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP ）；分子分型； 内参PCR；诊断试剂盒；评估 III Application of Polymerase Chain Reaction assay for Detecting of Brucella and Study of Molecular Typing of Brucella Abstract In order to mark up for a dificiency in the appoach of microbiology and serological detection of Brucella. To explore and establish a rapid method of molecular typing of Brucella. The study is started by following three aspects of research. First of all, To analyze a great number of partition Brucella of types sequence which have been issued as specific genotype, Searching for the distributing role of genotype- specific nucleotides, designing the specific primers, applying PCR method to identify specific type of Brucella . Established PCR-SSCP meth