延边黄牛成纤维胞培养、冷冻保存及核移植效率的研究.pdfVIP

延边黄牛成}f纷细胞培养、冷冻保存及核移植效率的研究…冲史摘要 摘要 本试验以延边黄牛耳皮肤成纤维细胞保存为基础，利用组织块培养法，首次建立了延边 黄牛耳皮胜成纤维细胞系，并对成纤维细胞进行液氮冷冻保存，得到延边黄牛耳皮肤成纤维 细胞最佳保存体系。通过从屠宰场收集卵巢，回收卵丘卵母细胞复合体(CoCs)，以成熟培养 后的去核卵母细胞作为核受体，以成纤维细胞作核供体进行核移植，研究了延边黄牛成纤维 细胞的生物学特性、冷冻保存效果及克隆技术的应用。结果表明： l通过组织块培养法，获得了传代培养的延边黄牛耳皮肤成纤维细胞，延边黄牛皮肤成纤 维细胞在体外培养时呈贴壁生长，原代与早期传代细胞是上皮细胞与成纤维细胞的混合物； 壁悬浮的主要为成纤维细胞，在传代过程中采用反复消化法将二者分离纯化，获得可正常传 代的延边黄牛耳皮肤成纤维细胞，表明采用反复消化法可以得到纯化的成纤维细胞系； 3通过绘制生长曲线研究了延边黄牛耳皮肽成纤维细胞的增嫡规律，用DM叫培养延边黄 牛耳皮肤成纤维细胞，传代后滞留期较短，约有一天左右，活细胞逐渐贴壁生长。此后进入 对数生长期，延续六天左右。第八天细胞发生接触抑制而开始死亡，细胞数量进入平台期， 维持三天左右，细胞逐渐脱落死亡，细胞数量有所下降： 4染色体检测表明，延边黄牛耳皮肤成纤维细胞在适宜的培养体系，至少可以传至15代 并保持染色体倍性正常； 5在以延边黄牛耳皮肤成纤维细胞不同甘油浓度与不同血清浓度情况下进行冷冻试验中， 得到最适合实验操作的甘油浓度为1096，血清的浓度为2096，复苏率可达到96％。 6在以不同密度与不同冷冻保护剂进行冷冻试验中，得到适合延边黄牛成纤维细胞冷冻保 存的密度为2×l06cells／IIlL，冷冻剂为甘油，复苏率可达到98％。 7冷冻保存的延边黄牛成纤维细胞复苏时，分别以20℃及37℃不同温度解冻，结果表明： 37℃条件下进行解冻复苏率优于20℃(pO．05)。 8本实验采用延边黄牛卵丘细胞、输卵管上皮细胞及耳皮肤成纤维细胞分别进行核移植， 所得结果显示发育率差异不显著，但三种细胞所得胚胎分裂率差异显著(P0．05)，其中卵丘 细胞效果最好。 9分别使用第5～7代与ll～13代延边黄牛耳皮肤成纤维细胞进行供核操作时，5～7代 (P0．05)。 10未冷冻保存与冷冻保存的延边黄牛耳皮肤成纤维细胞用做体细胞克隆供核细胞时，结 果显示未冷冻保存细胞所得卵裂率高(PO．05)，但发育率差异不显著(P0．05)。 关键词：延边黄牛；体细胞克隆；成纤维细胞：冷冻；耳皮肤 延边费小』：_!z纤维钏胞培养，冷冻保存及核移{fi设牢的研，Z～．英史摘要 Abstract t0 a『1d Y越Bian earskin’sfibrobIast went 6broblast 、veset Caitle 1ifle，and f÷cezing up preserving Y抽Bian ear t}lcbest about Cattleskin’s肪roblast，basedon byIiqllidni们gell，getprcServ崦sysfem obtainedatYanB证ms recoveredme 吐1etis吼lecul血．Ov嘶eswere JaLlghcemouse，aJldcoC’s， nuclear wercenucleated donorⅥ研e邡roblast，we rcceptor oocytes矾er腓蚰呲ioIl，nuclear and