药物诱导性反转、鹌鹑及其属间杂交种胚胎性别相关基因表达规律的研究.pdfVIP

药物诱导性反转鸡、鹌鹑及其属间杂交种胚胎性别相关基因表达规律的研究 摘 要 禽类的胚胎发育过程十分复杂，导致胚胎死亡的因素是多方面的。鸡与鹌鹑属间杂交的早期胚胎发 育过程有一个死亡高峰期，至出壳后鉴定个体全部为雄性且完全不育，这些现象用普通意义上的胚胎死 亡原因无法解释。本研究主要从形态学上观察鸡与鹌鹑属间杂交种的形态发育差异，通过胚蛋注射的 方法对鸡、鹌鹑以及其属间杂交种胚胎进行处理，观察Formestane 和 17β-estradiol 对其性别分化的 影响，探讨ER 等基因在鸡、鹌鹑以及其属间杂交种胚胎药物处理前后基因表达规律与鸡与鹌鹑属间 杂交种胚胎早期死亡的关系而展开本实验。 1 鸡、鹌鹑以及其属间杂交种胚胎发育的形态学观察 目前关于鸡和鹌鹑胚胎发育形态的研究已有较详细的报道，但对杂交禽胚胎发育形态的实验研 究未见报道。本实验以杂交禽、鹌鹑和鸡为实验材料，从其入孵至出雏，取活体胚胎做解剖和拍照， 通过解剖显微镜观察其发育特征，进行比较分析，结果表明：杂交禽、鹌鹑以及鸡的胚胎从整体上 观察，形态发育差异不大；时间上比较，杂交禽发育进程比鸡的快比鹌鹑慢，并且在 9 天之前差异 较大。 2 Formestane 和17β-estradiol 诱导鸡、鹌鹑胚胎性反转的研究 性激素对孵化早期的家禽胚胎性别有很大影响，给正常孵化的鸡、鹌鹑种蛋注射 17β-雌二醇和 芳香化酶抑制剂，可分别将其性别诱导为雌性和雄性。为了研究验证Formestane 和 17β-estradiol 对 鸡和鹌鹑胚胎性分化的影响，本试验根据家禽性别分化的机理，利用 100µg/ml 的 Formestane 和 50µg/ml 的 17β-estradiol ，通过胚蛋注射的方法对3 日龄的鸡胚和2 日龄的鹌鹑胚进行处理，观察 Formestane 和17β-estradiol 对鹌鹑性别分化的影响。结果表明，注射Formestane 和17β-estradiol 的鸡 胚和鹌鹑胚都发生了性反转。同时对杂交禽也采取和鹌鹑同样的方法进行处理，但结果显示死亡率 很高，出壳率基本为零。据此推测，注射药物引起基因表达紊乱很可能也是杂交种全部死亡的原因 之一。 3 ER 、3β-HSD 、P450c17 和P450arom 基因的表达量分析 鸟类胚胎的性分化在早期受性激素影响，特别是雌激素在性分化中起着非常重要的作用。而体 内雌激素一般是由胆固醇转化产生，这一转化过程需要羟基类固醇脱氢酶（在家禽中主要有3β-HSD 及P-450c17 等类固醇类基因）和P450arom 基因的作用。本实验采集72、96、120、144、168、192h 的鸡、鹌鹑和杂交种胚胎各10 枚，在胚胎性别鉴定的基础上，运用实时荧光定量PCR 方法检测ER 、 3β-HSD、P450c17 和P450arom 四个基因的表达量，发现作为ER 的调控基因，3β-HSD、P450arom 和P-450c17 基因的表达在杂交种中都表现出提前表达的趋势，而ER 既提前表达，而且其表达的量 也表现出与其亲本有较大差异，同时其表达的时间与其胚胎死亡的时间基本吻合，因此可以猜测ER 很可能在杂交种胚胎早期死亡中起着较为关键的作用。 4 凋亡因子bcl-2 和p53 基因的表达量分析 鸡和鹌鹑胚胎发育早期各个时间段bcl-2 、P53 基因表达模式的研究尚未见报道，本试验采集72、 96、120、144、168、192h 的鸡、鹌鹑和杂交种胚胎各10 枚，在胚胎性别鉴定的基础上，运用实时 荧光定量PCR 方法检测bcl-2 和p53 基因的表达量，发现雌性胚胎bcl-2 表达高峰点与其P53 表达最 低水平相吻合；与鸡和鹌鹑胚胎比较，杂交胚胎在72、120 h bcl-2、P53 基因表达出现异常，因此可 以猜测bcl-2 、P53 基因异常表达很可能也是引起杂交种胚胎早期死亡的原因之一。 I 药物诱导性反转鸡、鹌鹑及其属间杂交种胚胎性别相关基因表达规律的研究 5 性诱导后ER 等基因的表达量分析 性激素在鸟类早期胚胎的性分化过程中有很大的影响，本试验采用荧光定量PCR 方法研究外源 激素处理的鸡和鹌鹑胚胎不同时期的 ER 、3β-HSD、P450c17 、P450arom、bcl-2 和p53 基因表达