转录因子结合位甲基化检测及其基因转录调控效应的研究.pdfVIP

摘要 转录因子结合位点甲基化检测及其基因转 录调控效应的研究 摘要 甲基化是最常见的DNA表观遗传修饰，在基因表达调控中发挥重要作用。目前检测 DNA甲基化的方法各种各样，但绝大多数程序繁琐，且不能将甲基化检测结果与其基因表 达调控效应联系起来，难以用于基因表达的表观遗传调控机制的研究。因此，建立一种简单 而高效的可同步检测DNA甲基化及其基因表达调控效应的新技术非常必要。 本论文研究的目的是基于我们实验室多年研究的双链DNA微阵列(dsDNA microarray) 技术，建立一种可同步高通量检测基因调控区，特别是转录因子结合位点(Ⅱ旧S)DNA甲 基化及其基因表达调控效应的新方法。该方法的基本方案是：设计针对某一转录因子靶基因 调控区TFBS的寡核苷酸探针，将其共价交联固定在96微孔板孔内，制备出检测基因调控 的dsDNA微孔板分为两半：一半与抗甲基胞嘧啶抗体反应，再与相应的绿色荧光标记二抗 反应，实现对DNA正负链上甲基化的检测；另一组与转录因子蛋白反应，再与转录因子一 抗反应，最后与红色荧光标记二抗反应，实现转录因子对TFBS结合的检测。 E2F结合。结果表明，该微孔板能够准确检测出这些E2F．BSs在所检细胞中的甲基化，检测 结果与文献报道及本论文对个别位点的亚硫酸氢盐处理DNA测序抽检结果完全一致，说明 本论文设计的方法能够准确检测基因调控区DNA甲基化。 转录因子E2F对13个结合位点的结合检测结果表明，E2F结合位点上的甲基化能够定量 化干扰E2F的结合，但不同链上的甲基化对E2F结合的干扰效果截然不同。实验发现位于E2F 结合链上的甲基化能够显著抑fl刘E2F结合，而位于DP结合链上的甲基化对E2F结合几乎无影 响。甲基化对E2F结合的干扰与E2F靶基因表达的荧光定量PCR检测结果一致，可见甲基化 通过抑制E2F结合而抑制E2F靶基因的表达。这些研究结果说明，本论文设计的方法可检测 出基因调控区甲基化对转录因子结合的调控作用。 基于这些研究，本论文提出并论证了一种简单而高效的可同步检测DNA甲基化及其基 因表达调控效应的新技术。该技术在甲基化检测上无需亚硫酸氢盐处理、免疫沉淀、PCR 扩增等繁琐的程序，同时实现对甲基化多基因、多位点、正负链的高通量检测：同时可在分 子相互作用水平检测出甲基化对转录因子结合的调控效应。因此，本论文为基因表达的表观 遗传调控机制的研究提供了一种新技术。 关键词lDNA甲基化、转录因子、结合 Detectionof in methylation fact( sitessitesandmd‘。its et。’l。。ect‘ binding binding regulatory ’ on geneexpression Abstract DNA isolleofthemostcoininon modifications，and methylation epigenetic playsimportant to rolein for iscrutial regulatory geneexpression．r11托methodsdetectingmethylation of