微生物工程(发酵)第二章 菌种制备原理与技术精品.pptVIP

高通量筛选技术： 2.3 微生物原生质体育种和基因组改组育种 2.3.1 原生质体的特征 对外界变化更敏感； 对诱变剂更敏感； 对某些噬菌体失去敏感； 2.3.2 微生物原生质体再生育种 ①出发菌株的选择 ②菌体的活化 ③原生质体的制备 ④原生质体再生 ⑤菌株的分离 ⑥筛选 原生质体的制备： 酶解法 预处理： 细菌（青霉素）；放线菌（甘氨酸）； 霉菌（脂肪酶）；酵母菌（EDTA或巯基乙醇） 置于稳定剂中； 酶的选择 ： 放线菌、细菌（溶菌酶） 霉菌 （蜗牛酶或纤维素酶） 酵母 （蜗牛酶或葡聚糖酶） 原生质体再生（细胞壁） 双层平板上，半固体培养基中； 2.3.3 微生物原生质体诱变育种 原生质体技术＋诱变育种技术 出发菌株的选择 菌体的活化 原生质体的制备 诱变育种 原生质体再生 菌株的分离 筛选 2.3.4 微生物原生质体转化技术 整条染色体DNA、片段DNA或者质粒DNA转化原生质体获得转化子的育种技术； 出发菌株的选择 菌体的活化 原生质体的制备 转化 原生质体再生 菌株的分离 筛选 2.3.5 微生物原生质体融合技术 用物理、化学或生物学的方法处理两亲株原生质体，促使其融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，通过筛选而得到集二者优良性状于一体的稳定融合子； 出发菌株的选择（具有较大遗传差异的近亲菌株） 菌体的活化 原生质体的制备 原生质体融合 原生质体再生 菌株的分离 筛选 原生质体融合 两亲株原生质体混合于高渗透压的稳定剂中，在促融剂的诱导作用下，接触融合成异核体，经核融合成杂合二倍体，再经染色体交换产生重组体，称融合子； 物理方法：电融合、激光融合 化学方法：PEG（1000-6000分子量） 2.3.6 基因组该组育种 在微生物全基因组改造中快速进行特定群体的基因交换重组，从而增加群体遗传多样性，改良群体中个体性能等的连续遗传改变及表型选择过程； 人工诱变+原生质体融合 2.4 微生物的基因工程育种 2.4.1 基因工程育种是指重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（细胞），实现遗传物质的重新组合，并使得目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术； 主要步骤： 目标DNA的获得 目的基因与载体的重组 将重组基因转入宿主细胞 重组子的筛选 2.4.2 基因工程菌的发酵特性 代谢途径的扩展 新的代谢途径 不稳定性 不稳定性： 重组质粒发生DNA片段脱落； 质粒丢失 表达产物不稳定 应对措施： 施加选择压力； 控制基因过量表达； 控制培养条件； 2.4.3 基因工程菌的安全性 第二章 微生物菌种制备原理与技术 思考题： 工业发酵菌种的基本要求； 常见工业发酵的菌种； 从自然界筛选目标菌株的方法与步骤； 菌种退化的概念及主要防止措施； 菌种复壮的概念及主要措施； 菌种保藏的主要方法； 诱变育种的基本概念； 微生物原生质体再生育种的基本步骤； 微生物原生质体诱变育种的基本步骤； 微生物原生质体转化技术的基本步骤； 微生物原生质体融合技术的基本步骤； 基因组改组育种的基本概念； 微生物基因工程育种的概念及基本步骤； 基因工程菌的发酵特性； 基因工程菌的安全性如何？ 2.1 发酵工业微生物菌种 2.1.1概述 菌种是微生物工程的核心； 选育、保藏、复壮 2.1.2 发酵工业常用微生物种类 细菌 主要生产氨基酸、核酸、酶、多糖、有机酸等 常用菌种： Escherichia coli; Bacillus subtilis; Lactobacillus lactis; Corynebacterium glutamicum 放线菌 主要生产抗生素、某些特定的酶； 常用菌种： Streptomyces lividans; S. coelicolor; S. hygroscopicus; Micromonospora echinospora; Actinoplanes ferrugineus; 酵母 主要生产酒精、有机酸、 单细胞蛋白 常用菌种： Saccaromyces cerevisiae Pichia pastoris Candida glabrata C. tropicals Phaffia rhodozyma Yarrowia lipolitica 霉菌 主要生产：抗生素、有机酸、酶、色素； Penicillium chrysogenum Aspergillus niger A. oryzae Rhizopus oryzae 2.1.3 发酵工业微生物的基本要求 遗传稳定 易于产生繁殖体 必须是纯种或明确的少数几种菌组成的简单混菌系统，不应带有杂菌及噬菌体； 种子的生长必须旺盛、迅速； 产生所需产物的时间短； 容易分离提纯； 有自身