金黄色葡萄球菌清8型荚膜多糖的提取纯化及其偶联物免疫学特性的研究.pdfVIP

摘 要 金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎（cow mastitis ）的主要病原菌之一，而荚膜多 糖和黏附素是金黄色葡萄球菌最主要的毒力因子。当金黄色葡萄球菌侵入机体后，由 于荚膜多糖的抗吞噬作用，使其难以被吞噬细胞吞噬清除，进而细菌的黏附素识别并 特异性的黏附到组织、细胞的特定分子上是感染的关键，细菌成功定植后，进一步产 生酶和毒素，使得感染难以控制。因此本文通过化学方法将荚膜多糖和黏附素蛋白偶 联，制备偶联物，并对其进行免疫学特性的研究。从而为构建金黄色葡萄球菌荚膜多 糖-黏附素蛋白二价毒力因子疫苗奠定了理论和实验基础。 本实验研究在哥伦比亚固体培养基中添加不同的营养成分，通过观察菌落生长情 况，从而对金黄色葡萄球菌的培养条件进行优化。用此条件培养的金黄色葡萄球菌菌 株，采用加酶法对血清8 型荚膜多糖进行提取，并用酚提蛋白法和过柱层析法对提取 的粗糖进行纯化，同时用苯酚-硫酸法测定多糖含量。在获得纯化的血清 8 型荚膜多 糖的基础之上，以己二酰肼为间桥，碳二亚胺为偶联剂，纯化的ClfA-FnBPB 融合蛋 白为载体蛋白，使CP 和ClfA-FnBPB 偶联制备偶联物。在偶联过程中确定荚膜多糖- 蛋白质偶联物的最佳质量比。其次，利用紫外光谱扫描法、苯酚-硫酸法等对偶联物 进行定性和定量分析并计算偶联比。最后，用制备的偶联物免疫 BalB/c 小鼠，同时 用间接 ELISA 法检测抗体水平，并对小鼠进行攻毒保护试验，评价免疫效果。 结果显示，产生血清8 型荚膜多糖的金黄色葡萄球菌在加有 1％乳糖、2 ％NaCl 和 10％胎牛血清的哥伦比亚固体培养基上生长最旺盛。用此条件培养的菌株提纯的 荚膜多糖，其粗糖的纯度为34.43 ﹪，精制多糖的纯度为79.68 ﹪。核酸和蛋白的含量 为0.1365mg/mL 。用化学方法制备的荚膜多糖-蛋白质偶联物在其质量比为1:2 时可 证明偶联成功，计算得到偶联比为1：1.89。采用间接ELISA 法检测抗体水平，二免 后7 天，偶联物组可产生抗体，且抗体效价最高可达1:6400，说明偶联物刺激小鼠产 生了免疫应答。阴性对照组和单独多糖组均没有抗体产生，而单独融合蛋白组在二免 后产生了抗体反应，但抗体效价较低，最高时仅为 1:100。本实验对三免后两周的小 鼠进行攻毒保护，结果表明，偶联物组的攻毒保护率最高，可达 80 ﹪，而阴性对照 组、单独多糖组以及单独融合蛋白组的保护率分别为20 ﹪、30 ﹪和60 ﹪，可见荚膜 多糖-蛋白质偶联物有较好的免疫原性，达到了本实验的预期目标。 关键词：金黄色葡萄球菌；血清8 型荚膜多糖；黏附素蛋白；偶联物；免疫原性 Study the extraction, purification of CP8 and the immunogenicity of conjugate in CP8 from Staphylococcus aureus Abstract Staphylococcus aureus is one of the most significant pathogens which causes the bovine mastitis. And we considerd the major virulence factors is capsular polysaccharide and adhesin of S. aureus. When S. aureus invasion of the body, it can’t be cleared easily by phagocytic cell, because of resisting the phagorytosis of capsular polysaccharide. Further more, the bacterial adhesin recognised and adhered to the organization and definite molecule of cell. The infection is hard to control when bacterium produce enzymes and toxins a