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康小热：hok／sok介导的质粒稳定性研究 hok／sok介导的质粒稳定性研究 研究生：康小燕 导师：朱固强教授 专业：预防兽医学 中文摘要中又捅斐 基因工程菌工业化生产过程中，重组质粒不稳定性现象，一直是一个亟待解决 的既有理论意义又有实际应用价值的重要问题。重组质粒的不稳定性一般具有2种 表现形式，一种是结构(序列)不稳定性，即重组质粒上某一区域的DNA序列发生插 入、缺失、重排、修饰等现象，导致其表观生物学功能的丧失：另一种是分离(分配) 不稳定性，是指整个重组质粒DNA分子从受体细胞中逃逸或丢失的现象。在质粒不 稳定性的研究过程中，人们关注最多的，通常是质粒的分离不稳定性。以非抗生素 为选择压力的质粒解离后致死系统(PSK，post—segregationalkillingsystem)是解决质 粒分离不稳定性的有效方法之一，即该系统并不直接参与质粒DNA的复制，而是在 质粒发生不稳定分离后，杀死无质粒的子代细胞，从而在细胞传代中保持质粒稳定 mRNA(hok RNA)。其作 mRNA)，以及一段可以阻止该mRNA表达的反义RNA(sok 用机理基于“毒剂与解毒剂”的原则，即在含质粒细胞中，sokRNA能够迅速与hok 解，而hokmRNA仍留在细胞中，不断聚集并充分表达，产生的毒素蛋白杀死细胞， 因而保证了存活的细胞中均含有质粒，提高稳定性。 I位点， 拷贝质粒pACYCl84为载体，将稳定性基因hok／sok插入到载体上的BamH 扬州人学硕十学何论文 合。 84．hoUsok的重组菌DH5a， 对所构建的含质粒pACYCl 含质粒 复的传代培养，以考察重组菌株的分离不稳定性及宿主细胞连续分裂时无抗生素选 择压力的添加对质粒稳定性的影响。其具体方法如下：在不含抗生素的LB培养基中， 进行连续传代，每隔一定的世代间隔，将收获的细菌菌液适量稀释，涂布于空白LB 平板。再分别挑取单菌落100个点种至含氯霉素的LB平板，对氯霉素敏感的重组菌 菌落其质粒细胞已经丢失；同时挑取具有氯霉素抗性的单个菌落，采用标准碱裂解 I酶切鉴 法抽提质粒，以进一步确定质粒的存在。并将传代前后的重组质粒经Sph 定，并设置空载体pACYCl84作对照。为了进一步检测晟。觚。足基因的引入对于宿主 细胞生长的影响，绘制两重组菌生长曲线，含质粒pACYCl84的工程菌与重组菌平 行培养作对照。 84．hok／sok 试验结果表明，在无抗生素筛选压力下连续传代，含质粒pACYCl I酶切图谱没有发生变化，进一步的DNA序列测定表明，插入的hok／sok基因 粒Sph I酶切结果 没有发生突变。重组质粒pACYCl84．hok／sok(M)传代前后的质粒Sph 虽然没有发生变化，但由于其传代时间较短，因而不具有遗传学意义。生长曲线的 其低生长速率与该重组质粒的不稳定性密切相关。 康小燕：hok／sok介导的质粒稳定性研究 84．hok／sok具有良好的分离稳定性， 宿主细胞连续分裂过程中，重组质粒pACYCl 虽表现出一定的分离不稳定性，但仍然能够在无抗生素选择压力条件下，在50世 代内保持质粒的基本稳定遗传，该性能已经足够满足工业生产的需要。 粒