jsrv表面蛋抗原表位的筛选及检测试剂盒的制备.pdf

摘 要 研究背景：绵羊肺腺癌（ovine pulmonary adenocarcinoma , OPA ）是由 β- 反转录病毒属绵羊肺腺瘤病病毒 （jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV ）引 起的一种传染性肺脏肿瘤性疾病，世界动物卫生组织将其列为 B 类传染病 。 目前国内对该病的诊断主要依靠常规病理学方法检测，严重障碍了我国对 OPA 的防控 。 主要目的：建立快速特异的实验室及适用于基层的诊断方法，为临床 及 基 层 检 测 诊 断 提 供 技 术 支 持 ， 为 进 一 步 分 析 表 面 蛋 白 （ surface protein,SU ）蛋白的功能、疫苗设计及对 JSRV 的生物学特性研究提供素材。 研究方法： 以获得的三株抗 JSRV- SU 蛋白的单克隆细胞分泌的 McAb 为一抗，应用噬菌体展示结合肽探针扫描技术，鉴定三株单抗所识别的线 性表位；并应用非竞争性 ELISA 法测定三株单抗的功能性亲和常数；以阳 性标准病料与健康阴性羊肺组织为样本，以纯化的多抗和单克隆 抗体为基 本检测试剂，建立双抗体夹心 ELISA 检测方法；针对外源性 JSRV U3 区 设计特异性引物，建立 JSRV 的环介导等温扩增 （Loop - mediatedisothennala mplification ,LAMP ） 检测方法，并 以 700ng 健康羊基因组 DNA 为背景进 行敏感性和特异性试验；通过基因克隆技术对 JSRV env 及绵羊 ras 基因进 行序列测定；运用基因重组方法构建 JSRVenv 重组真核表达质粒，并通过 脂质体转染建立稳定表达细胞系。 研究结果： 1.三株单抗 3B3 、3D6 、 1D6 的亲和常数分别为 5.06×109 L/mol ﹑ 5.82×109 L/mol ﹑ 2.91×109 L/mol ； 且 其 所 对 应 的 抗 原 表 位 分 别 为 156 1 63 71 8 1 98 1 04 W APEGTPD ，F SYQSQHPHCI ，D EKTGKR ； 2 .首次基于 JSRV- SU 蛋白的单抗建立了夹心 ELISA 法，并建立了阴性 与阳性的判定标准（ 当 P/N≥2.21 时判为阳性；当 P/N1.85 时判为阴性； 当 2.21P/N≥1.85 时判为可疑）； 3. 在 国 内 首 次 基 于 内 外 源 性 病 毒 长 末 端 重 复 序 列 （ long terminal repeat ,LTR ）的差异建立了 LAMP 诊 断方法，所建立的反应体系在恒温水 浴锅中作用 60min 即可得到其特有的阶梯状条带，而且对内源性 JSRV 的 扩增结果为阴性，该方法对 JSRV 前病毒 DNA 的最小检测限为 10 拷贝， 灵敏性高于一步 PCR 方法。LAMP 和特异性 PCR 及套式 PCR 方法检测 临床样品的符合率分别为 92 % 和 100% ； 4. 通过基因克隆技术对 JSRVenv 及绵羊 ras 基因进行序列测定， 结果 发现，本研究克隆的 pMD -exJSRVenv 1 属于 Ⅱ型 exJSRV ；而 pMD -exJSRV env2 属于 Ⅰ型 exJSRV ；在 exJSRV 氨基酸序列中存在“YXXM” 基序；绵羊 ras 基因与已知其他物种的该段基因作比对差异率较小，基本保守，且与牛 的 ras 基因同源性最高； 5. 成功构建了含有 env 及 tm 基因的重组真核表达质粒 pcDNA3.1 -env 及 pcDNA3.1 -TM-HA ，并建立了稳定表达 JSRV 囊膜蛋白（Env ）及其 TM 亚基的 HepG2 细胞系。 结论：本研究建立了特异性检测 JSRV 的夹心 ELISA 法和 LAMP 法， 对于我国养羊业的健康发展，具