毒害艾美球虫cna文库的构建和基因筛选.pdfVIP

摘 要 艾美球虫、疟原虫、巴贝斯虫、弓形虫、隐孢子虫、住肉孢子虫等)。在这些寄生虫中，寄生在 肠道上皮细胞的艾美球虫(Eimeria)主要破坏家禽肠道上皮细胞，从而威胁家禽健康和导致全球 范围内养禽业的严重经济损失。长期以来球虫病的防治以药物为主，但是由于球虫抗药性的普遍 存在，新药研制费用昂贵，加之药物或抗生素在家禽产品中的残留问题越来越受到消费者的关注， 迫使人们寻求防治的新途径。在众多控制球虫病的方法中，基因疫苗防治前景诱人，而要研制高 效的基因工程疫苗关键在于寻找最佳的虫体抗原基因。本研究以毒害艾美球虫(Enecatrix)为 研究对象，从其普通生物学和分子生物两方面鉴定其为纯种，后用其孢子化卵囊构建了cDNA表 达文库，从中筛选免疫抗原基因，获得了以下结果。 1．按照传统生物学鉴定方法选取潜在期、寄生部位、最短孢子化时间、卵囊形状、卵囊大 小及孢子囊大小等指标对毒害艾美球虫(广东株)进行了鉴定。获取了毒害艾美球虫的一系列生 物学特性，从而初步验证了该单卵囊分离株是纯种。为了进一步验证该虫株是纯种，分别利用柔 嫩艾美球虫(Etenella)、巨型艾美球虫(Emaxima)和堆形艾美球虫(Eacervulina)的特异 性引物，对纯化的卵囊DNA进行PCR扩增，结果扩增不出来这些引物相应的目的片段，从分子 生物学角度验证了该虫株是纯种。 2．用纯化的毒害艾美球虫孢子化卵囊口服接种感染雏鸡，制备鸡抗毒害艾美球虫阳性血清； 用纯化的毒害艾美球虫孢子化卵囊超声裂解后的可溶性蛋白作为抗原加佐剂乳化后免疫家兔，制 备兔抗毒害艾美球虫阳性血清。经ELISA检测，结果表明仅兔抗毒害艾美球虫阳性血清可用于毒 害艾美球虫cDNA表达文库的免疫学筛选。 3．以毒害艾美球虫孢子化卵囊为材料，利用SMART蹦cDNA文库构建试剂盒成功构建了毒 2．62x10m 100 bp之间． pfu／mL，文库重组率为97．5％，插入片段集中在500～l 4．利用兔抗毒害艾美球虫阳性血清对毒害艾美球虫孢子化卵囊cDNA表达文库进行免疫学 筛选，共获得3个阳性克隆。经鉴定，3个阳性克隆基因序列一致，基因的阅读框为344 bp，共 编码133个氨基酸。登录GenBank进行同源性比较，结果该基因与已发表的毒害艾美球虫核糖体 小亚基RNA基因、柔嫩艾美耳球虫核糖体小亚基RNA基因有很高的同源性，分别为98％和9r7％， 说明该基因为毒害艾美球虫核糖体小亚基RNA基因。同时，用文库整体转化质粒方法对文库进 因的同源性为97％。 关键词：鸡；球虫；毒害艾耳球虫；cDNA文库；免疫筛选 Abstract The is of of Phylum composed Apicomplexa entirelyparasiticprotists，includingmanypathogens andmedical veterinary and various caused intracellular infections，coccidiosis Sarcocystis)．Amongparasitic byobligate ofthe Eimeriaisthe constraintformodern protozoanparasite genus major poultryproduction． the variousEimeria threa