海鱼异尖线虫分检测和鉴定技术的研究.pdfVIP

摘要 异尖线虫足世界各大海域鱼类普遍寄生的寄生虫。人误食寄生在海鱼体内的 异尖线虫科某些种的活的III期幼虫可引起异尖线虫病(Anisakiasis)。到目前为止 已报道可引起人异尖线虫病的主要有6种异尖线虫，即简单异尖线虫臼nisakis 虫(Psetwloterranova decipiens)、对盲囊线虫(Contracaccum spp．)和宫脂线虫 国家和地区的增多，人类异尖线虫病在全球已呈扩散趋势。因此，鱼类异尖线虫 病病原的人体感染具有重要的公共卫生学意义。1993年，异尖线虫病被列入《中 华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》。因异尖线虫种类繁多， 不同种类的异尖线虫对人类的致病性有所不同。因此，对异尖线虫种类进行准确 的鉴定不仅是从事异尖线虫研究的基础，也对防治人和动物的异尖线虫病具有重 要意义。 本研究以鱼类异尖线虫幼虫为研究对象，对近年来厦门口岸进口的各种海水 鱼类以及厦门地区销售的多种海水鱼类的异尖线虫感染情况进行调查，结果表明 蓝圆鳕(Decapterus 很高，灰海鳗(muraenesoxcinereus)、带鱼(Trichiurus macracanthus)也普遍感染异尖线虫，其中蓝圆鳕、竹荚鱼的简单异尖线虫的感染 率达到100％。根据形态学特征对检获的异尖线虫幼虫进行初步分类后，用通用 引物扩增异尖线虫幼虫的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列片段，对PCR 产物进行回收并克隆到pGM—T载体中，挑取阳性克隆进行测序，根据基因序列 对虫种进行鉴定。结果共获得简单异尖线虫、典型异尖线虫、针蛔线虫 trichiuri)和对盲囊线虫等4种异尖线虫。以这4种异尖线虫为研 (Raphidascaris 究对象，根据软件分析，挑选限制性内切酶肼∥I、RsaI对其ITS序列进行酶 切试验，建立了能准确、特异和快速地鉴别简单异尖线虫、典型异尖线虫、针蛔 线虫和对盲囊线虫4种异尖线虫的PCR．RFLP方法。 简单异尖线虫足我国海鱼异尖线虫寄生的优势种，也是感染人体最常见的异 尖线虫。本研究第二、三两章丰要以简单异尖线虫为研究对象，根据其ITS保守 Green 序列分别设计特异性引物，建立环介导等温扩增(LAMP)和SYBRI实 和2对引物的浓度，以及反应温度、反应时间等因素进行优化，并进行灵敏性和 特异性试验，同时用7份样品进行鉴定。经优化后的LAMP反应体系为：0．8 mmol／LdNTPs、10mmol／L M92+、0．8mmol／LBetaine、0．21xmoi／L夕f、弓I物、 Bst xThermoPol DNA聚合酶大片段、1 bufer以及适量的 1．6limolFL内引物、8U 模板，反应程序为：62。C反应60min，80℃灭活5min。本方法检测简单异尖线虫 的灵敏度达到10拷I)2／lxL，与典型异尖线虫、对盲囊线虫、针蛔线虫无交叉反 应，7份样品鉴定均为阳性。本研究建立的简单异尖线虫荧光定量PCR鉴定方 法的标准曲线的相关系数达0．999；特异性强，不能扩增典型异尖线虫、对盲囊 线虫和针蛔线虫；灵敏性高，可以检测到10拷贝／¨l的ITS重组质粒。结果表明 Green LAMP方法和SYBRI实时荧光定量PCR法灵敏性高、特异性强，都是 鉴定简单异尖线虫的有效手段。其中LAMP法更快速、所需设备更简单、操作 更简便、费用更低，更适合基层实验室应用。 典型异尖线虫也是引起人异尖线虫病的主要病原之一，国内对典型异尖线虫 Green 的报道很少。本研究建立了鉴定典型异尖线虫SYBR I实时荧光定量PCR 方法。该方法具有快速、特异、敏感、可定量等优点，是鉴定典型异尖线虫的有 效手段。 Green 本