淀粉糖化酶抗体研制及其双抗夹心elisa法的初步建立与应用.pdfVIP

淀粉糖化酶抗体的研制及其双抗夹心ELISA法的 初步建立与应用 oftheMonoclonal Preparation Antibodies against andEstablishmentand ofthe PreliminaryApplication SandwichELISAMethod Double—antibody 研究生：张丹 导师：王捍东教授 学科：临床兽医学 Dan M．S．Candidate：Zhang Supervisor：Prof．WangHandong 扬州大学兽医学院临床兽医学教研室 2012年6月 中文摘要 中文摘要 淀粉糖化酶(GA)能将淀粉转化成低分子量糖类，在制糖行业得到了广泛应用，在这 样的植物糖制品中一般都有糖化酶的残留。蜂蜜中葡萄糖和果糖的含量约为65％，是极易 以糖掺假的食品。近年来，我国蜂蜜质量安全问题不断出现，2002年欧盟及一些国家对中 国蜂蜜采取禁进和停止销售的贸易壁垒，给中国养蜂业带来了很大的损失。因此，为了监 测蜂产品中的掺糖造假，建立一种快速检测蜂蜜中掺入的外来淀粉糖化酶(失活或未失活) 的方法具有十分重要的现实意义。 蜂蜜中掺糖造假的检测方法主要有碳稳定同位素比值分析法(SlRA)、红外光谱鉴别法、 高效液相色谱法等。SIRA对鉴定蜂蜜中掺入C4植物糖有很好的效果，但对掺入以C3植 物为原料生产的淀粉糖不能鉴别，给检测蜂蜜是否存在植物糖掺假带来一定的困难：红外 光谱鉴别法虽然前处理简单，操作步骤方便、快捷，鉴定的准确度较高，但是设备昂贵， 操作技术要求高；高效液相色谱法灵敏度高，但设备昂贵，前处理净化要求高。免疫学方 法，特别是酶联免疫吸附法(ELISA)，由于其具有灵敏度高、检测速度快、特异性强、样 品前处理简便、操作简单、实用性强的优点，得到了大范围的推广。本试验旨在研究一种 快速准确检测蜂蜜中淀粉糖化酶残留的酶联免疫学方法。 本研究采用淀粉糖化酶免疫新西兰大白兔，获得抗淀粉糖化酶的多克隆抗体， 疫原免疫BALB／c小鼠，利用杂交瘤技术和单克隆抗体技术获得了12株可稳定性分泌针对 胞株采用体内诱生法制备腹水，腹水的效价均为1：1×104以上。 采用抗体叠加试验对这6株抗糖化酶单抗的抗原识别位点进行检测，反应增值结果表 HRP)标记McAb．6H9D8，为建立双抗夹心ELISA方法提供特异性的酶标抗体。 分别用多抗和用单抗包被，建立双抗夹心ELISA方法。结果显示，以单抗包被为基础 中文摘要 Ⅱ 一 建立的检测方法特异性更强，灵敏度更高。本试验中，用特异性单抗和酶标特异性单抗相 结合建立双抗夹心ELISA检测法。 2 00， 包被抗体(McAb-2H4F9)的最佳包被浓度为1mg／L，GA溶液的最佳稀释度为1：1 法特异性良好，与叶淀粉酶(a．G)和B．呋喃果糖苷酶(p．F)无交叉反应。将该方法初