猪圆环病毒感染分子克隆构建及sirna对rep基因表达抑制研究.pdf

摘要 猪圆环病毒(PCV)是当前严重危害世界养猪业的重要病原之一。PCV除了是 传染病的“罪魁祸首”之外，还可以导致母猪繁殖障碍、猪呼吸道综台征、仔猪 先天性震颤等诸多疾病。同时，该病毒感染主要侵害机体的免疫系统，导致免疫 抑制，造成继发感染。PCV对养猪业造成的直接、间接损失十分巨大，从而备受世 界兽医界的关注。此外，猪群中广泛存在着PCV感染，在猪的器官及食源性产品 中PCV检出率也较高。故PCV还存在突破种间屏障并通过食物或器官移植等途径 传播给人的潜在可能。但到目前，世界上还没有一种有效方法应对PCV感染。寻 求预防、治疗PCV感染的途径显得尤为迫切。 本论文主要在PCV的诊断方法、感染性分子克隆和siRNA对PCVI red基因表 达的抑制作用等三方面开展了研究，为PCV的基因功能和免疫预防研究奠定基础。 主要研究内容如下： 1．PCV2、PRV和PPV多重PCR诊断方法的建立与应用 法完全相同。表明：建立的多重PCR具有高度的准确性，可以用于临床PCV2、PRV 发挥重要作用。 2．PCVI感染性分子克隆的构建 从IBRS一2细胞中分离鉴定了PCVI，并通过PCR方法获得了其全基因组序列， 序列分析表明该毒株与其它PcVl毒株间的同源性都在98％以上；构建了PCV．I双拷 转染PK-15细胞后可以形成具有感染性的病毒。 3．嵌合病毒PCVl一2感染性分子克隆的构建 的ORFImRNA和PCV2的ORF2 ORF2蛋自的表达，表达蛋白主要分布于细胞核。表明：构建的PCVI一2分子克隆转 染细胞后形成了具有感染性的嵌合病毒。 堕堕!塑塞壁銎竺坌三塞隆构建及siRNA对rep基因表达抑制研究 4．sil{NA对PCVl rep基因表达的抑制作用研究 自的表达质粒：构建了red基因与EGFP融合的真核表达质粒 蛋白呈弥散性分布于整个细胞；将s 均对red基因的表达产生了显著的抑制作用，其中siRNA(C)的抑制作用最强， siRNA(B)次之，siRNA(A)最弱。 5．以EGFP为报告基因的PcVl分子克隆的构建 细胞48小时后可以在细胞中检测到特异性荧光，荧光主要分布于细胞核，表明在 转染细胞中有PCVl的ORF2和EGFP蛋白的表达；将转染后的细胞连续盲传3代， 的表达，但不能传代。 关键词：猪圆环病毒；多重PCR；分子克隆；siRNA；抑制 2 堕里要堕量墨墨堡坌三塞堕塑堡墨!!坠坠翌竺￡薹里壅竺塑型至壅 Abstract Porcine asall infectious for circovirus(PCV)recentlyemergedimportant pathogen intheworld．Itis asthe causal of pigs recognized agent post-weaningmultisystemic dermatitisand wastingsyndrome0MWS)andporcine nephropathy hasbeen PCValso associatedother as disordersin many diseases，such reproductive disease and SOWS，pordnerespi