同时检测四种病菌的pcr方法的研究.pdfVIP

山东农业大学硕十论文 中文摘要 食品安全突发事件频率高是近年来食品安全问题的一个显著特点， 在各种食品安全事件中，细菌性食物中毒则是食物中毒的重要因素。常 见的食源性致病菌主要有金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核增生李斯特 氏菌、致泻性大肠杆菌等。目fji『，国内检测食品中致病菌主要采用传统 的培养方法，其操作繁琐，检测时间较长，通常需要一周才能完成，且 灵敏度较低。近年来，针对某一种或一类致病菌的检验方法被建立起来， 但是一旦检测的方向有误就会造成时间和药品的浪费。因此，急需建立 一种快速有效且通量较高的检测方法。 为建立一种同时检测四种常见动物源致病菌的PCR方法。本研究针 对大肠杆菌的(16s．23s rRNA)基因、金黄色葡萄球菌的(nue)基因、单增 李斯特氏杆菌的(hlyA)基因以及沙门氏菌的(invA)基因分别设计合成 了四对特异性引物，PCR扩增的目的基因片段分别为662 bp、484bp、 372 bp、284bp。试验过程中对多重反应体系中引物添加量、镁离子浓 度、dNTP添加量及退火温度、延伸温度等影响要素进行优化，确定了 bufier 适宜的多重反应体系和扩增程序，其反应体系为10xPCR5此， mM)4 U)1 M92+(25mM)3gL，dNTP(25gL，Taq酶(2．5pL，模板各2此， 引物按文中所述终浓度各1．5此，无菌双蒸水补齐至50肛L。多重PCR min， min，94℃变性45s，57℃退火1 扩增程序为：94℃起始变性5 min30 min。 70℃延伸1 S，扩增32个循环，最后一个循环于70℃延伸20 建立的多重PCR方法具有敏感、特异、准确、快速的优点，检测 时间为5h左右。为研发同时检测人畜共患病食源性主要致病菌即大肠 杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏杆菌及沙门氏菌的试剂盒奠定了 基础。 关键词：多重PCR：食品检测；大肠杆菌；会黄色葡萄球菌；单增李 斯特氏杆菌；沙门氏菌 Abstract Food are safetyemergencies inrecent high these frequency years．In food problems，the resultof poisoning Bacterial wasthemoSt Pathogens todatacamefrom harmful．According and hospitals main departments，mebacterial were pathogens aureus．