最新DNA序列分析。.ppt

DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。确定DNA双股链上每一个独立结构单元或碱基的确切顺序。 DNA序列的正确测定，是进行基因结构和功能分析，绘制基因图谱、转基因检测等方面工作的重要前提。同时DNA测序技术为快速、简捷分析蛋白序列及结构提供了工具。 DNA测序的发展： 1953年，Watson和Crick推导出DNA双螺旋结构； 1954年，Whitfeld发明化学降解测序法； 1972年，Berg开发DNA重组技术； 1975年，Sanger发明加减测序法； 1977年，Sanger发明双脱氧测序法； 1986年，第一台半自动测序仪出现； 2000年，Drosophila全基因组测序完成。 DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括sanger双脱氧链终止法和maxam-gilbert化学降解法。20实际80年代中期，测序仪出现。发展至今，自动化测序已成为当今DNA序列分析的主流。美国pe abi公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。 最早的测序技术 测序技术最早可以追溯到20世纪50年代，早在1954年就已经出现了关于早期测序技术的报导，即Whitfeld等用化学降解的方法测定多聚核糖核苷酸序列。 第一代测序技术诞生 1 9 7 7年S a n g e r等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。 此后， 在S a n g e r 法的基础上，80年代中期出现了以荧光标记代替放射性同位素标记、以荧光信号接收器和计算机信号分析系统代替放射性自显影的自动测序仪。另外，90年代中期出现的毛细管电泳技术使得测序的通量大为提高。除此之外，这一时期还出现了一些其他的测序方法，如焦磷酸测序法（pyrosequencing）、连接酶测序法（sequencing byligation, SBL）、杂交测序法（sequencing by hybridization, SBH）等。 第二代自动测序技术 尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。经过不断的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序技术诞生了。 与第一代技术相比，第二代测序技术不仅保持了高准确度，而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度。使用第一代Sanger的测序技术完成的人类基因组计划，花费了30亿美元巨资，用了三年的时间；然而，使用第二代SOLiD的测序技术，完成一个人的基因组测序现在只需要一周左右的时间。由于第二代测序技术产生的测序结果长度较短，因此比较适合于对已知序列的基因组进行重新测序，而在对全新的基因组进行测序时还需要结合第一代测序技术。 第三代基因组测序技术实现单分子速读 据《自然》杂志网站2月8日报道，在美国佛罗里达州马可岛召开的“基因组生物学与技术进展大会”上，来自加利福尼亚门洛帕克市的太平洋生物科技公司(Pacific Biosciences)介绍了其研制的第三代基因组测序仪，该测序仪实现了一次标记一个分子式的单分子速读。 碱基特异性化学切割反应： 硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。 肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。 在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。 G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。 G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。 T+C反应：肼（低盐） C反应：肼（高盐） 测定DNA长度~250bp。 与 PCR反应类似。 反应体系中包含：模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物； 反应过程： 变性－复性－延伸－终止 Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸） ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。 反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般3~4 ：1)。 Sanger第一步：加入复制终止剂 ddNTPs参与下的DNA复制 Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP与dNTP的比例，比