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北京元业伯乐科技发展有限公司 PCR概念 定量PCR 实时荧光定量PCR三个关键词： 实时，荧光，定量 如何实时检测？？？ 借助荧光物质示踪扩增产物量的变化 荧光曲线 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图 定量原理 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 引入两个概念： 荧光阈值、Ct值 定量原理 Ct值的概念 阈值选择 阈值的选择 定量原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 Absolute（绝对定量） Determines input quantity of a nucleic acid target Requires a standard curve Relative（相对定量） Determines fold differences in input target nucleic acid quantities between samples Performed with or without a standard curve Typically used for gene expression analysis with a target gene normalized to a reference gene 相对定量 相对定量?CT 法 ——未进行归一化 经过校正??CT法 ——校正加入反应体系当中模板量 ——通常使用内参进行校正 ??CT ??CT —认为扩增效率为100% —只能使用一个内参进行校正 Pfaffl Modification —根据扩增效率进行分析 —只能使用一个内参进行校正 Vandesompele Method —根据扩增效率进行分析 —可以使用多个内参进行校正 ?CT Relative Quantification Relative Quantification DCt 方法: (没有内参) 表达倍数 : 4 DDCt 方法: (有内参) 表达倍数 : 8 Pfaffl 修正: (内参+效率) 表达倍数 : 7.5 关于SYBR Green I 一种最基础的实验手段 SYBR Green I 融解曲线分析 提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量PCR技术延伸 基因分型（SNP）检测 熔解曲线分析 实时荧光定量PCR技术简介： 多重PCR 在一个PCR管中进行多个不同的PCR反应： 同一样本，多对引物，分别扩增不同的靶基因 目标基因 内参照基因（看家基因） 不同荧光标记的探针识别不同的靶基因 内参照基因 解决模板提取过程中造成的差别 解决样品材料不均一造成的差别 解决加样过程中的差别 内参照基因 多通道技术 多通道技术： 使用多种荧光染料 在不同的检测通道内同时测定多种不同 荧光染料发出的荧光 1、引物及探针问题---引物及探针的相互干扰 2、不同PCR反应要在同样扩增条件下进行 2、模板量差别---共用资源的相互竞争 多重PCR技术问题 一个PCR管内进行多重PCR扩增要解决的问题： F R R Q F R R Q F R R Q R Q 多重PCR技术问题 1、引物及探针相互干扰问题 F R R Q F R R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q 2、共用资源的相互竞争 多重PCR技术问题 单双通道同时进行，相互验证 F R R Q F R R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q R Q 单 单 双 多重PCR技术问题 提纲 PCR简介 荧光定量PCR技术原理 荧光化学物质简介 多重PCR与内参照基因 定量PCR技术延伸 熔解曲线分析 基因分型（SNP）检测 实时荧光定量PCR技术简介： Reference GOI 21 Tissue #2: Tissue #1: 20 22 24 Delta Ct #2: Delta Ct #1: 22-21 = 1 24-20 = 4 1st Delta Delta Ct: 4-1 = 3 2nd Delta Fold