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提纲 第一部分 RNA干扰理论基础 一、RNA干扰概述 二、 RNA干扰的机理 第二部分 RNA干扰技术应用 一、小干扰RNA(siRNA)序列设计 二、 siRNA的合成 三、 siRNA的转染 第三部分 RNA干扰在中药学上的应用展望 一、RNA干扰概述 1、 RNA干扰定义 2、 RNA干扰简介 3、 RNA干扰研究简史 2、 RNA干扰简介 RNAi的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程；此外， siRNA本身还是一种极具前景的基因靶向药物，可广泛地用于诸如癌症等疾病的治疗。鉴于siRNA技术的巨大意义与广阔应用前景，2002年美国《科学》杂志将其评为全球年度十大科学进展之首。 第二部分 RNA干扰技术应用 一、小干扰RNA(siRNA)序列设计 二、 siRNA的合成 三、 siRNA的转染 一、小干扰RNA(siRNA)序列设计 1、 siRNA的一般结构 2、siRNA靶位点的选择 二、 siRNA的合成 1、化学合成 2、体外转录 3、用RNase Ⅲ 消化长片断双链RNA制备siRNA 4、体内表达 1、化学合成 许多公司可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 　　最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究 　　不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素 一、 RNAi在证候-基因组研究中的应用 二、 RNAi在中药生产中的应用 《老子》说:“万物负阴而抱阳”；《易经》说：“一阴一阳谓之道”。 有过多的mRNA,siRNA就会与之结合,进而把它降解来完成机体的自稳(阴阳的对立制约), mRNA的降解进而又转换成siRNAs以继续执行功能(阴阳的相互转化),siRNAs和mRNA互根互用、消长平衡来完成机体的自稳及清除外来的病原体。 证候研究是中医科学研究的重点和难点,也是制约中医发展的颈瓶。人类基因组学研究的方法学内容与中医学的整体观、辨证观有许多相似之处。在微观水平的基因调控与修饰,反映着生命机体的整体功能状态,基因组的多样性高度强调了每个人的基因特异性。因此如何揭示证的本质,如何把证候和现代科学联系起来是值得中医研究者去思考的。 展望 优点 作为实验工具使生物学研究发生革命性变化 siRNA 文库的建立,将能快速高效地研究几乎每一个决定特异生物学表型的基因的功能.(与传统基因敲除效应、突变相比较) 减小突变动物死亡率.(与传统基因敲除效应、突变相比较) 作为药物其免疫原性较小（相较于蛋白质多肽） 与反义技术相比，因为有放大效应，效果强烈持续时间长。 缺点 作用机理尚不完全明确，给序列设计带来了一定的麻烦 作为药物易降解体内半衰期短 谢谢 一、RNAi在证候-基因组研究中的应用 一、RNAi在证候-基因组研究中的应用 广州中医药大学脾胃研究所通过基因芯片研究,筛选出了脾气虚证核糖体蛋白下调基因RPS20、RPS29、RPL35、RPL27;同时也进行了脾气虚证异病同证差异基因研究,通过收集溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)脾气虚证及湿热证患者结肠病变黏膜,制作核糖体蛋白的低密度芯片,筛选出多条下调基因。证候基因组学的深入发展必然要求对这些基因的功能进行综合评价,寻找其中的关键基因,并明确差异基因相互作用的关系,对证候本质进行深入研究。 一、RNAi在证候-基因组研究中的应用 因此,在此基础上,该所采用RNAi技术在IEC-6细胞上对脾虚证关键基因RPS20的功能进行了鉴定。结果提示,干扰IEC-6细胞RPS20后,细胞形态结构发生改变,细胞迁移、增殖能力受到抑制,表明小肠上皮细胞可能存在着消化吸收功能低下及黏膜修复减慢趋势。此结果说明了RPS20可能在脾虚证发生发展中起到了重要的作用。 RNA 干扰是一种新型反义技术, 即把dsRNA 导入细胞引起同源mRNA 降解， 可抑制特异基因的表达, 对药用植物次生代谢产物的生物合成途径进行调控, 达到调控天然产物生物合成的目的. 张荫麒利用反义DNA或RNA 片段导入亚麻植物毛状根中抑制肉桂醇脱氢酶活性, 使分支代谢中木质素的合成受到抑制, 而使主要抗癌活性成分5-甲氧基鬼臼素的含量提高. 二 RNAi在中药生产中的应用 * * RNA 干 扰 技 术 一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻