拟南芥抗致病疫相关基因acs9的功能验证及其启动子活性研究.pdf

摘 要 乙烯作为一种植物激素，对植物种子萌发、生长发育、衰老、果实成熟、性 别决定等都有着重要的影响，同时参与抵抗逆境胁迫如机械伤害、冷害、渍水、 病原菌入侵等以及参与植物细胞的程序性死亡。ACC 合酶是乙烯合成途径中的限 速酶，本实验室在前期研究中利用致病疫霉接种不同生态型拟南芥，初步确定 ACC 合酶中的 ACS9 基因为抗致病疫霉相关基因。为了深入研究 ACC 合酶参与抗致病 疫霉的机制和信号传导途径，本试验利用反义 RNA 和 RNAi 技术对 ACS9 基因功 能进行了初步研究。克隆了 ACS9 基因上游不同长度的调控序列，并构建了 GUS 表达载体，研究了该基因的表达特性。结果如下： （1）构建了 ACS9 基因反义 RNA 和 RNAi 载体 pCAMBIA1300-ACS9A 和 pCAMBIA1300-ACS9i 。将pCAMBIA1300-ACS9A 和 pCAMBIA1300-ACS9i 载体经 农杆菌介导转化拟南芥。通过潮霉素筛选，得到了 18 株反义 RNA 转化子和 13 株 RNAi 转化子。经 PCR 鉴定，外源基因已成功整合到了转基因植株的基因组中。 RT-PCR 结果表明，转基因植株中ACS9 基因的表达均受到不同程度的抑制，确定 所得转基因植株均为ACS9 基因的（反义 RNA/RNAi ）突变体。 （2 ）经RT-PCR 分析发现，突变体病害防御反应中乙烯信号转导途径的下游 基因 PDF1.2 的表达受到了抑制；对突变体进行暗培养，“三重反应”消失；突变 体接种致病疫霉后表现感病症状，确定ACS9 基因参与了调控拟南芥中乙烯介导的 病害防御反应。 （3 ）用PLACE 和 PLANTCARE 软件分析ACS9 基因的启动子，发现该序列 具有启动子的基本元件 TATA-box 和 CAAT-box，此外还发现了光应答元件 G-Box、 GATA 和刺激诱导元件 MBS 和 LTR 等多个顺式作用元件。 （4 ）成功构建了带有 GUS 报告基因的含有 ACS9 基因不同长度调控序列的植 物表达载体，发现不同长度的调控序列均具有启动子活性；GUS 瞬时表达定量检 测与组织化学染色结果表明长度为 953 bp 的调控序列启动子活性最强，推测ACS9 基因上游 953 bp~1 232 bp 之间可能存在负调控元件。 关键词：拟南芥；致病疫霉；ACS9 ；启动子；瞬时表达 Functional confirmation and promoter activity of Phytophthora infestans-defense related ACS9 gene in Arabidopsis Author ：PAN Yong-gang Supervisors：DONG Jin-gao LIU Ying-chao Major ：Plant Pathology Abstract Ethylene, one of the major phytohomornes, plays a significant role in plant, such as seed germination, floral differentiation, growth, development, decrepitude, sex determination, and fruit setting as well as in various stresses such as wounding, freezing, drought, pathogen infection and so on. 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylic Acid Synthase (ACC Synthase) is the rate-limit