玉米大斑病菌cmp依赖性蛋白激酶a基因的克隆与功能分析.pdf

摘 要 玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica ）是玉米上的一种重要丝状病原真菌，引起 的玉米大斑病（Northern Leaf Blight of Corn ，简称NCLB ）是威胁玉米生产的一种重 要的叶部病害。研究表明，cAMP 信号转导途径在病菌的生长发育和致病过程中发挥 重要作用，蛋白激酶 A 是该途径下游的主要效应分子。本研究首先利用抑制剂试验 初步确定了基因的功能，应用候选基因法和 Genome Walking 技术克隆了玉米大斑病 菌的 cAMP 依赖性蛋白激酶 A 调节亚基基因（PKA-R ）全长序列和催化亚基基因 （PKA-C ）同源片段，并对其进行了生物信息学分析、基因缺失突变体分析等方面的 研究，为进一步明确 cAMP 信号转导途径在玉米大斑病菌致病过程中的作用提供了理 论依据。 本文利用 PKA 特异性抑制剂 H89 处理玉米大斑病菌孢悬液，结果发现分生孢子 的萌发和附着胞的形成均受到抑制。H89 随着浓度的增加，对孢子萌发和附着胞形成 的抑制作用明显增强；同一浓度下，抑制剂对附着胞形成过程的抑制作用大于孢子萌 发过程。初步确定了 PKA 在病菌分生孢子萌发和附着胞的形成过程中起重要作用。 根据已知植物病原真菌 PKA-R 和 PKA-C 基因的保守核苷酸序列设计简并性引 物，以玉米大斑病菌基因组 DNA 为模板，扩增获得了 PKA-R 和 PKA-C 基因的同源 片段。利用 Genome Walking 技术对所得的基因片段进行延伸，获得了 2688 bp 的 PKA-R 基因全长序列和 1382 bp 的PKA-C 基因片段。Southern 杂交技术确定了PKA-R 基因和 PKA-C 基因在玉米大斑病菌基因组中均以单拷贝形式存在。 生物信息学分析表明，PKA-C 基因编码氨基酸序列与烟草赤星病菌（Alternaria alternata ）、小麦颖枯病菌 （Phaeosphaeria nodorum ）、小麦黄斑叶枯病菌 （Pyrenophora tritici-repentis ）等病原菌的PKA-C 蛋白同源性达 69%～85%；比对PKA-R 基因 DNA 和 cDNA 序列发现，该基因没有内含子，开放阅读框为 1398 bp，编码465 个氨基酸 残基；蛋白的分子量约为 50.437 kD，等电点 pI5.68 ，编码蛋白与小麦黄斑叶枯病菌 （P. tritici-repentis ）、小麦颖枯病菌（P. nodorum ）、灰霉病菌（Botryotinia fuckeliana ） 等病原菌的 PKA-R 蛋白同源性达 58%～88%。PKA-R 蛋白为亲水性细胞质蛋白，没 有预测到信号肽和跨膜结构，二级结构预测表明，PKA-R 蛋白由 α-螺旋（34.84% ）、 β-折叠（13.55%）、β-转角（4.52% ）和随机卷曲（47.10% ）组成。 为进一步研究基因功能，试验构建了 PKA-R 基因的双交换同源重组型基因敲除 载体及 PKA-C 基因的 RNA 干扰载体。对 PKA-C 基因的 RNA 干扰载体质粒利用 PEG 介导法转化玉米大斑病菌的原生质体，潮霉素筛选共获得了 11 个转化子。以潮霉素 磷酸转移酶基因 hph 为探针，经 Southern 杂交验证，确定了转化子 m5-1 为突变体。 对突变体 m5-1 进行表型分析，发现其生长速率降低，菌丝节间变短，且不产生分生 孢子。 关键词：玉米大斑病菌；环腺苷单磷酸；蛋白激酶 A ；RNA 干扰；功能分析 Cloning and Functional Analysis of the cAMP-dependent Protein Kinase A Gene in Setosphaeria turcica Author ： WANG Miao-miao Major ： Plant Pathology