武夷菌素生物合基因族的克隆及分析.pdfVIP

摘要 vat． 武夷菌素(Wuyiench)是由不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicus 诱变的方法选育武夷菌素高产菌株虽然取得了一些进展，但仍不能满足育种和生产上需要。因此， 采用分子生物学方法提高武夷菌素效价具有非常重要的意义。本研究构建了武夷菌素产生菌基因 组文库，克隆武夷菌素生物合成基冈簇并且分析了其功能。此外利用诱变的方法筛选到了武夷菌 素生物合成阻断突变株。结果如下： cfu／ml，文库可覆盖基因组4倍以上。根据同类型抗生素生物合成基因设计特异性引物，最终确 定以人环内酯类聚酮合成酶基因设计的引物筛选基因组文库。 2．采用PCR方法对基因组文库进行筛选得到了三个阳性克隆，对阳性克隆酶切后测序最终 得剑了长度为32509 bp的片段，G屹含量为71．4％，与链霉菌基因组高G+C含量的特征相符。 生物信息学分析表明武夷菌素可能是PKS I型抗生素(聚酮类化合物)，以模块形式合成。该序 为27855 bp，为克隆到的最长序列，其编码的蛋白质包含5个聚酮合酶(KS)，5个酰基转移酶 构成了合成中的五个模块：off4编码武夷菌素生物合成中的硫酯酶(TE)，参与聚酮长链的环化 和水解；off5为一种转录调控因子，编码的蛋白质属于LuxR蛋白家族，在转录过程起正向调节 作用。 3．以武夷菌素产生菌CK-15为出发菌株，通过诱变处理得到一株丧失抑菌活性且性状稳定 的突变株N1。突变株孢子丝为长螺旋形，孢子呈椭圆形，与出发菌株相比，在形态上没有显著 变化且产孢量无变化。突变株的抑菌谱发生了显著变化，对所有8种供试菌株均无抑制作用。高 效液相色谱分析发现突变株中抗生素的特征峰消失。 武夷菌素生物合成基因簇的克隆为今后采用分子生物学方法改造菌株和研究抗生素代谢途 径奠定了基础。抗生素生物合成阻断突变株是推断抗生素合成途径的良好材料，武夷菌素生物合 成阻断突变株的筛选为抗生素生物合成途径研究提供依据，同时也为武夷菌素生物合成基因功能 验证提供了受体。 关键词：武夷菌素，基冈组文库，基因簇，阻断突变株 Abstract anovel Wuyiencin，producedbyStreptomycesahygroscopicusvar．wuyienMs，isagricultural with antibiotic andresearch titerof hasbeen highfungicideactivity values．Although Wuyiencinlargely isstillhardtO titer improvedpreviously,it satisfypracticalneeds．Therefore，improvingWuyiencin’Sby molecularis critical．The of strainwas biologybecoming genomiclibraryWuyiencin producing constructedinthe clusterwasclonedanditsfunctionsⅥ俚：咒 research．Wuyiencinbiosynthetic gene oneblocke