苏云金芽孢杆菌异性cry基因的研究.pdf

从Bl菌株Btc001中克隆r一种新的c∥，，口基I^I，被Bt毒蛋白基冈国际命名委员会 命名为c，y』肠8基网。Accession 酸细成，等电点为pH5．995。 川DET一2lb载体分别构建了表达cw，尼，和c叫』如8基【列的重组质粒pETB一1IE和 体表达cry基因。表达产物crylIel对鳞翅目害虫亚洲玉米螟(伪一f曲知，Ⅳ∞口f括)和小 2lppm，接近对 菜蛾(P，妣!肠xy如s把妇)两种试虫具有高毒力：对亚洲玉米螟Lc50为16 玉米螟毒力最高的crylAb基因，对小菜蛾的Lc50为19788n∥mL：crylIa8对玉米螟和 但未发现两者对鞘翅目害虫榆兰叶甲妒少ma加口enPscP”5)有活性。这两种基因的克隆为 玉米螟等鳞翅目害虫的防治提供了新的基因来源。： 2．对甜菜夜蛾有活性的c删基因研究 从Bt菌株J8中克隆了一种cwJC口基因，编码1189个氨基酸组成的蛋白质，分子量 置，Blockl在152-181、Block2在225-269、Block 5在605．614氨基酸之间。同源比较发现该蛋白与已知的crylca氨基酸序列存在差异， n啪ber 已为Bt毒蛋白基因国际命名委员会命名为c删』c口7基因。GenBaf止的Accession 为AYo】5492。从Btc008中分离了】种∞，，c臼基因，序列分析发现与∞，』C臼7完全同源。 number为AY007686，被Bt毒蛋白基因国际命名委员会正式命名为cw，c62 两种基因插入表达载体pET_2lb后，在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达， 显示高活性，Lc50为2．74n∥mg饲料干重；对玉米螟和小菜蛾没有显示活性，crylcb对 小菜蛾显示中等毒力，Lcso为7．97“∥mL。c∥』c白7基因的克隆为鳞翅目夜蛾科害虫甜 菜夜蛾的防治提供了新的基因来源。龟 3．c删基因的定点诱变及Domain替换研究 ：用PcR方法，得到不同长度的c，y』c口7基因5、．端片段，分别编码由611个氨基酸组 l到6ll一645氨基酸位点之间。上述工作为转基因植物的杀虫基因表达载体构建提供了理 论依据。 crylca7一M5(A124E)，经分析此位置位于Domain I的q3螺旋，这种改变降低了对甜菜 夜蛾的活性。 2 墨j!壅些查兰垡主堂垡堡塞 塑墨垒蔓塑堑堡笪量壁!型苎塑塑竺壅 用重叠引物PcR法，成功构建crylIel蛋白DomainI、儿和crylca7蛋白的Domain ll的c端37个氨基酸，没有表 1lI融合蛋白crylca7．z9。由于缺少cryll“蛋白Domain 现山对甜菜夜蛾的活性。 定点诱变和Domain互换的研究在国内均属首次，有关方法的建立缩小了与国外在此 领域的差距。 4．c删基因在Bt菌株中的表达研究 用重叠引物PCR法，成功构建了Bf—EcD疗穿梭的表达载体psxY422b。该载体带有 c棚■口7基因不依赖芽孢形成的强启动子、sTAB．sD序列及pET-21b的表达序列。 sDs．PAGE电泳发现∞，，，P』基因的表达产物在培养上清液中，证明∞，』尼，基因在无晶 体突变株中BE20中成功获得表达；将psHY一1IE导入Bt自然菌株Uv．17中，构建成功 率达100％ 将pSHY．1cA表达载体分别导入无晶体突变株BE20和自然菌株Bt22，构建了工程 获得表达。BiotIcOl和Bi0Ⅱc02均对甜菜夜蛾显示高活性，培养液杀虫死亡率分别达100 ％和98．4％。 c，)’托台7基因在cw姐口7基因启动子的作用下，在LB培养液中培养14个小时就开 始表达，并能在受体菌BE20中稳定存在，说明c似刊口7基因的启动子是一个表达时间较 长的强启动子，适于表达c矽基因。 以上结果证明，采用自行构建的表达载体psxY422可以在无晶体突变株中商效表达 c删基因，这是一套较为完善的Bt表达体系。、 关键词：BtcAPs甜菜夜蛾沉默基因定点诱变Domain替换重叠引物P