转基因pemg及hahr3作物的获得及功能分析.pdfVIP

中文摘要 来源于稻瘟菌（Magnaporthe grisea）的激活蛋白pemG1能促进种子萌发和幼苗 生长，提高棉花烟草的抗病性。棉铃虫(Helicoverpa armigera)是一种危害性非常大的 农业害虫， 由于它的取食寄主比较广泛， 每年都给我国及全世界造成巨大的经济损失， 长期使用的化学农药会使棉铃虫产生抗药性，也会造成环境污染。通过抑制其蜕皮来 达到杀虫目的是一条较好的途径。 本实验选择的目的基因是棉铃虫蜕皮调节转录因子  ­激素接受子3基因（HaHR3），它调控蜕皮过程中相关基因的表达，可与DNA上特定 的序列结合，参与蜕皮激素诱导的晚期基因的转录活性产物的调控。为探讨PemG1  蛋白在植物中诱导抗病性和促进生长的功能及通过应用植物介导的RNA干涉基因沉 默技术抑制蜕皮调节转录因子的表达，阻碍棉铃虫幼虫的正常变态发育，生态调控棉 铃虫种群数量，为棉铃虫的有效防治提供一条新的途径。 本文构建了含目的基因pemG1的植物表达载体pCAMBIA2300­Ubi­pemG1­Ocs， 通 过农杆菌介导法转化珂字312和中棉24棉花茎尖和下胚轴，经过一系列组织培养和茎 尖离体培养过程获得转化了抗性植株， 并对获得的抗性植株进行PCR、 测序、R T­PCR、  Southern检测，确定了转基因阳性植株，并对阳性株进行棉花枯萎病菌接种试验，观 察转基因棉花对棉花枯萎病的抗性；通过构建好了的含棉铃虫蜕皮调节转录因子  HaHR3基因的正反向RNA干扰载体pCAMBIA­RNAi­HaHR3，利用农杆菌介导法转化 三生烟叶圆片得到转基因烟草，通过相关分子检测，鉴定相关基因在受体植物内的整 合，转录，分析转基因植株的抗虫性状，这一研究为下一步通过植物介导的RNA干扰 技术防治棉铃虫打下了坚实的基础。本研究获得的主要结果如下：  1.构建了植物表达载体pCAMBIA2300­ pemG1, pCAMBIA2300­RNAi­HaHR3,该载体含 有组成型花椰菜病毒组成型启动子35S，章鱼碱合成酶基因终止子以及卡那霉素抗性 基因nptⅡ（neomycin phosphotransfers Ⅱ）。对载体进行了酶切和测序检测，通过冻融 法将载体转化了根癌农杆菌（Agrobactrium  tumefaciens）菌株LBA­4404,可用于农杆 菌介导法转化棉花和烟草。  2.分别通过农杆菌介导法转pCAMBIA2300­pemG1，pCAMBIA2300­RNAi­HaHR3棉花 下胚轴，茎尖，通过抗生素的浓度筛选及组合，继代培养基配方的摸索，激素组成的 调节等，最终得到经过卡那霉素筛选的抗性植株。  3.通过农杆菌介导法转pCAMBIA2300­RNAi­HaHR3烟草叶圆片法获得抗性植株，并得 到T2代。  4.通过PCR，PCR产物TA克隆测序验证阳性转化株。Southern  杂交验证了PemG1，  HAHR3在棉花，烟草中的整合，RT­PCR验证了pemG1,HaHR3的转录。  5.比较分析不同激素不同浓度组合的BAP和NAA生长激素对茎尖出芽的影响，结果确 I  定选取0.1 mg/L的BAP和NAA组合最适合芽的诱导；  6.分析了转pemG1棉花转化株的相关抗病性，农艺形状。HAHR3烟草转化株的抗棉铃 虫生测。对抗棉花枯萎病有一定的防治效果，HAHR3烟草转化株对棉铃虫的正常生 长发育起到显著的抑制作用。 关键词：转基因，激发子，pemG1,棉铃虫，蜕皮调节转录因子，RNAi，HaHR3，棉 花，烟草 II  Abstract  PemG1  activator  protein  from  Magnaporthe  grisea  is  able  to  promote  seeds  germination and seedlings growth, and also induce cotton and tobacco resistance against  plant disease. Cotton bollworm (Helicoverpa armigera) is a very harmful agricultural pests