葡萄病毒a m基因rna干扰载体的构建及其鉴定.pdfVIP

摘要 RNA干扰(RNA 导的抗病毒最有效的途径是构建病毒特定基因片段的反向重复序列载体，之后转入植物中，转录 后生成RNA发夹结构(hpRNA)，发夹结构的柄町诱导转录后基因沉默，从而达到抗病毒的目的。 利用根癌农杆菌介导的瞬时表达系统来研究植物基凶功能的报道很多，它不仅可以快速地导 入外源基凶，而且使转入基因在短时间内表达，从而在功能基因组学上面发挥巨大的作用。 葡萄病毒A(GVA)既是危害葡萄最为严重的病毒之一，分布广泛，又是少数能摩擦接种到 草木寄_丰的葡萄病毒之一，易十开展研究工作，可以带动其他病毒的相关理论问题和应用实践的 基本原理，构建了RNA干扰载体，并成功转化到根癌农杆菌中，通过瞬时表达来检测干扰载体的 抗性效果。丰要的试验结果如下： 1．基凶片段的克隆与序列分析：设计引物克隆质粒pDriver-MP中的一个基因片段，通过引物 段为目的基凶片段，可用于构建RNA干扰载体。 2．RNA干扰载体的构建：通过酶切、连接、PCR等方法将目的片段正反向分别插入到载体 1．GVAFR，经菌液PCR和酶切鉴定证明干扰 pFGC594l内含了的两侧，来构建干扰载体pFGC594 载体构建成功。 液PCR检测结粜表明获得了含有表达载体的农杆菌EHAl05。 4．瞬时表达分析：向本氏烟中注射农杆菌后接种GVA，通过表型观察和PCR检测得出： ①瞬时干扰作用具有时问依赖性：农杆菌渗入3d，4d，5d后接种GVA对病毒的干扰效果最 好，没有病症出现，而农杆菌渗入2d后接种GVA，则没有表现出任何抗性，全部观察到病症。 症，而对照组则全部表现病症。说明干扰载体在草本植物本氏烟上对GVA表现出较强的抗性，可 进一步在木本植物葡萄上进行研究。 关键词：葡萄病毒A；运动蛋白基凶MP；RNA干扰；载体构建；瞬时表达 Abstract RNA some lowmolecular interference(RNAinterference，RNAi)：When weight exogenous double—stranded intohost the mRNA， RNA(dsRNA)getcells，specificallydegradesequence-specific to mosteffectiveantiviralmediated leadingpost-transcriptionalgenesilencing(PTGS)．The way by RNAistoconstruct reverse transferredto form virus．specificrepeatgenefragments，then plants，and RNA handleof structure hairpin hairpinformation(hairpin—RNA，hpRNA)bytranscription，the induce achievetheantiviral genesilencing，thus purpose． A numberof aboutthe function large reports gene studythrough transient were cannot the expressionsy