重组酿酒酵母酯谢酶eht1、eeb1、tgl3的表达及其活性研究.pdfVIP

中文摘要 酯酶是啤酒酵母产生风味物质的重要代谢酶类。目前国内对于酿酒酵母酯代 谢酶的研究较少，因此对重组酯酶的体外催化活性进行测定，认识几种酯酶的催 化功能，研究其催化活性的差异，了解酵母酯类代谢酶的调控作用对酯类开发利 用有重要意义。本研究通过构建3种酯代谢酶基因ehtl(Genbank登录号 GU471250)的原核、真核表达载体，获得重组酯酶5种，并比较研究了不同重 组酯酶的催化活性及其产生风味物质的差异。 件，经镍螯合层析法获得可溶性His-EHTl和His．EEBl重组蛋白，蛋白含量分 别达到1．034medmL和0．683m【g／mL，而TGL3蛋白基本没有表达。 115 分别将3种酵母酯酶基因ehtl、eebl、tgl3成功导入毕赤酵母工程菌GS 工程菌。将筛选到的工程菌进行三角瓶培养，其诱导条件：pH6．0，甲醇终浓度 O．5％f每12h补加一次)，温度28。C，诱导时间96～120h，在此条件下，EHTl、 13．62 EEBl、TGL3蛋白的含量分别达到100．34mg／L，1mg／L，88．73mg／L。 利用生物信息学软件对三种蛋白的结构进行预测，发现EHTl蛋白和EEBl 蛋白的二级结构非常相似。对三种酯酶糖基化位点预测，EHTl蛋白中存在4个 糖基化位点，EEBl蛋白中存在2个糖基化位点，TGL3蛋白中存在2个糖基化 位点。通过水解酯实验对不同分子设计的重组蛋白进行酶活测定，证明其均具 有酯水解活性，真核重组蛋白的酶活力和比活力均高于原核重组蛋白。真核重 U／mg；TGL3 组蛋白EHTl酶比活力为74．569U／mg；EEBl酶比活力为81．614 酶比活力为34．570 U／mg。 通过诱导发酵实验比较EHTl和EEBl的重组毕赤酵母工程菌风味物质产生 的差异，固相微萃取(SPME)．气相．质谱分析表明，未加甲醇诱导时发酵后仅产生 苯乙醇，加入甲醇诱导后产生的风味物质明显增多，产生了较多酯类，如辛酸乙 酯，己酸乙酯，壬酸乙酯，癸酸乙酯等。表明毕赤酵母重组酯酶EHTl和EEBl 具有合成催化活性：EEBl、EHTl酯酶在酵母代谢过程中，参与中短链脂肪酸脂 的代谢合成。重组酯酶制备与功能的研究，为酵母风味物质代谢机理的理论研究 及酯代谢酶的开发利用奠定了基础。 EEBlTGL3 关糊：酿酒酵母酯代谢酶重组蛋白EHTl 毕赤酵母 AB STRACT Esterasesallthe estermetabolic forbrewer’S to important enzymes yeastsproduce flavonNowfew dotheresearch people aboutesteraseofScerev括iae．Sothe ofrecombinantmeasuredin the catalyticactivity enzymes vitro，understanding of differences andthe ofmetabolic function，the catalytic catalyticactivity regulation tothe andutilizationofester．In enzymes，areveryimportantdevelopment