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第三章 细胞生物学研究方法 ?细胞形态结构的观察方法 ?细胞组分的分析方法 ?细胞培养、细胞工程 复习纲要 第一节 细胞形态结构的观察方法 1. 光学显微镜技术（light microscopy） 2.电子显微镜技术 (Electro microscopy) 第二节 细胞组分的分析方法 1. 离心分离技术 2. 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法 3. 特异蛋白抗原的定位与定性 4. 细胞内特异核酸的定位与定性 5. 定量细胞化学分析技术 第三节 细胞培养、细胞工程 ?细胞培养 ?细胞工程 1. 光学显微镜技术（light microscopy) 1.1 普通复式光学显微镜技术 1.2 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 1.3 激光扫描共聚焦显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） 1.4 相差显微镜（phase-contrast microscope） 1.5 微分干涉差显微镜 1.6倒置显微镜 倒置显微镜 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。 微分干涉显微镜(DIC) 优点：能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。 用途：DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。 微分干涉显微镜(DIC) 计算机辅助的微分干涉显微镜可以得到很高的反差，其分辨率比普通光镜提高了一个数量级，这不仅填充了普通光镜与电镜之间分辨率的间隙，也为高分辨率下研究活细胞提供了必要工具。 2. 电子显微镜技术 2.1 透射电子显微镜的基本知识 2.1.1 电镜与光镜的比较 2.1.2 电镜与光镜光路图比较 2.1.3 电子显微镜的基本构造 2.1.4 主要电镜制样技术 超薄切片技术 负染色技术 冰冻蚀刻技术 2.2 扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM） 扫描电子显微镜 作用：用来观察标本的表面结构。 工作原理：用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子由探测体收集，并被转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 冰冻蚀刻技术 冰冻蚀刻也称冰冻断裂（freeze-fracture） 标本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，进行冰冻,然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。 负染色技术 负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右 超薄切片技术 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片厚20~50nm 普通复式光学显微镜技术 分辨率是指区分开两个质点间的最小距离 N=介质折射率；α=镜口角，λ=入射光波长 荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） 1.2.1原理：高压汞灯，激发滤片，阻断滤片 ?直接荧光标记技术 ?免疫荧光标记技术（间接标记） 1.2.2应用 ?在光镜水平用于蛋白质、核酸 等生物大分子的定性定位： 如绿色荧光蛋白(GFP)的应用 绿色荧光蛋白 GFP是一个分子量较小的蛋白，易与其他一些目的基因产物形成融合蛋白，且不影响目的基因产物的空间构象和功能。GFP与目的基因融合，