太平洋牡蛎类ft2基因的克隆与时空表达.pdfVIP

谨以此论文献给导师及所有关心支持我的人 姜 薇 万方数据 II 万方数据 III 万方数据 IV 万方数据 V 万方数据 VI 万方数据 太平洋牡蛎类FUT2 基因的克隆与时空表达 摘 要 诺如病毒（Norovirus ，NoV ）是人类急性病毒性肠胃炎的主要病原体，常引 起严重的公共卫生与食品安全事件。研究表明 NoV 依靠识别组织血型抗原 （histo-blood group antigens，HBGAs ）上的寡糖感染人体。太平洋牡蛎作为NoV 感染人体的重要载体之一，体内存在的类A 型组织血型抗原 （A-like HBGA ）能 够特异性富集NoV，并且富集NoV 的含量存在季节性变化趋势，这种季节性变 化趋势是否由类A 型HBGA 含量变化引起，类 A 型HBGA 的合成关键基因是 否影响其含量变化，目前尚未见报道。本研究以太平洋牡蛎类A 型HBGA 合成 途径中的关键酶α- 1,2-岩藻糖基转移酶 （类FUT2 ）为研究对象，开展了类FUT2 基因克隆与时空表达的研究，以期在分子水平上揭示太平洋牡蛎季节性富集NoV 的机理。 本研究通过同源克隆的方法获得太平洋牡蛎类 FUT2 基因的 cDNA 序列 （GenBank 登录号KJ184342 ）。研究结果表明，太平洋牡蛎类FUT2 基因cDNA 全长为1941 bp ，包含180 bp 的5΄非翻译区、编码361 个氨基酸的1086bp 的开 放阅读框以及675 bp 的3΄非翻译区。分子进化聚类分析结果显示，太平洋牡蛎 类FUT2 基因与家鼠（Mus musculus ）等哺乳动物的FUT2 基因聚为1 个分支。 对太平洋牡蛎类 FUT2 基因密码子优化后，构建重组原核表达载体 pRSET-mof，转化大肠杆菌BL21 ，经终浓度为1.0 mmol/L IPTG 在37℃诱导4 h 后表达产生目的蛋白，SDS检测分析目的蛋白的表达状况，并通过 6×His-Tag 标签的单克隆抗体和人类 FUT2 的单克隆抗体分别进行 western blotting 检测。结果显示，类FUT2 基因在大肠杆菌表达系统中成功获得表达， 表达产生的蛋白大小约为48 kDa（目的蛋白约为42 kDa，6×His-Tag 约为6 kDa ）， 与类FUT2 理论值（41.62 kDa ）相符；并且可以与抗人类FUT2 的单克隆抗体结 合。 针对太平洋牡蛎类 FUT2 基因序列设计实时荧光定量 RT-PCR 引物，采用 SYBR Green 染料法，以β-actin 为内参基因，基于Delta-Delta CT 相对定量法， 建立类FUT2 基因的实时荧光定量RT-PCR 检测方法，开展类FUT2 基因表达量