柿果acc合成基因cdna克隆及其植物表达载体的构建.pdfVIP

摘 要 柿果实属于跃变型果实，采收后极易软化，给柿果的贮藏运输带来不便。传统的 柿果实贮运保鲜不仅费用高且保鲜期有限，不能从根本上解决柿果的采后软化问题。 乙烯是一种成熟激素，利用转基因技术抑制或降低跃变型果实乙烯的生物合成，可以 降低果实乙烯的含量。ACC合成酶和ACC氧化酶是果实乙烯生物合成的限速酶，通 过转基因的方法抑制这两种酶的表达，可望提高跃变型果实的耐贮性能。本研究以柿 果实为材料，克隆分离了富有柿ACC合成酶基因，成功构建了该基因的反义和RNA 干扰表达载体，结果如下： PlantMini 1．利用Rneasyo Kit试剂盒成功提取了高质量的RNA，RNA的 Kit)， 该试剂盒性能稳定、反转录效率高，分离到的mRNA完整性好，为继后的RT-PCR 提供可靠保证。 3．根据已发表的平核无柿AcC合成酶的保守氨基酸序列，设计了多对简并引物， 经反复PCR扩增试验，筛选出了具有很好重复性的引物组合，上游引物为： AACCARCCCGGYTC一3’。 DNA 4uL，ddH2032．751aL，Ex Taq 脂糖凝胶电泳检测，获得了清晰且重复性好DNA谱带。 明该片段具有ACC合成酶的保守区氨基酸序列，与Genbank中平核无柿果的 DK．ACSl基因核苷酸序列只有一个核苷酸和一个氨基酸的不同，说明克隆到的片段 富有柿果ACC合成酶基因片段。 6．采用3’RACE试剂盒，从富有柿果中克隆出一条长912bp片段，经测序证明是 个核苷酸不同，所编码的氨基酸有一个不同，说明该序列是富有柿果的ACC合成酶 的3’末端核苷酸序列。 I和Sac 7．用限制性内切酶Sma I切割克隆到的富有柿果ACC合成酶核苷酸序 启动子下游，构建成反义表达载体pSMAK—ACS。 8．用x沈l和Sma 1分别酶切pBl22l质粒DNA和富有柿果ACC合成酶核苷酸 序列，将ACC合成酶的序列正向克隆到中间载体pBl221质粒中，构建成中间表达载 体pBl—ACS。 9．用Sma pSMAK—ACS质粒，切下中间载体质粒上的CaMV35S启动子和ACS的正义序列， 将其正向插入到切除CaMV35S启动子的反义pSMAK—ACS质粒，通过连接酶将两个 片段连接，构建成带内含子的反向重复序列表达载体pSMAK．ACS-RNAi。 EHAl01巾，经特异性引物对转化菌液进行PCR扩增，证实表达载体己转入农杆菌。 关键词：柿果；ACC合成酶；基因克隆；3’RACE：植物表达载体 its vector PersimmonACC and construction synthasegenecloningplantexpression Xia Author：Tang and Major：Primary storage productprocessing engineering Advisor：MaJun-lian Zi·de Zhang Abstract Persimmonclimacteric tobe fruit，a fruit，isdifficult