有机磷农药毒死降解菌玫瑰红红球菌mpd基因的克隆.pdfVIP

摘 要 毒死蜱是一种广谱性有机磷杀虫剂，被广泛用于农业和城市卫生害虫的防治。同 时毒死蜱也是一种持久性污染物，其残留对环境和人类健康有很大的危害。寻求高效、 安全、经济的农药残留生物降解处理新技术，解决病虫害防治用药与农药残留的矛盾， 是科研工作者需要迫切解决的科研命题。本实验对已分离得到的毒死蜱高效降解菌， 玫瑰红红球菌(RhodoCOCCUS 建基因工程菌做好前期研究。 实验采用SDS．蛋白酶K法提取D3菌基因组DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳检测， 有蛋白质和RNA的污染。由此可看出本研究制备的基因组的DNA片段完整、纯度 h、 高、浓度大，可以满足构建基因组文库的要求。采用同样的方法分别提取培养12 24h、36 h的D3菌基因组DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，培养24h所提的基因 组条带最亮。 本研究采用能切割4个核苷酸序列的内切限制酶Sau3AI酶(8U／I．t1)对基因组 DNA进行酶切，研究发现倍比稀释内切酶的方法比较容易寻找到最佳酶量，结果表 Sau3A 明在第l管中加入1lal 量酶切反应，回收浓度和效率有较大的提高。 稳定的特点，不需要酚抽提和乙醇沉淀，回收率在60％左右。 量在70％．80％以上，转化效率达106 cf-u／lxg。采用高效感受态细胞DH5a常规转化， 得到了近15000个转化子，远远超过了建库理论上需要的转化子。 参照文献中已经报道的用于扩增毒死蜱降解菌YC．1 m瑚馑因的引物，以D3菌基 因组DNA为模板进行PCR反应。经1％琼脂糖凝胶电泳，可以见到约为lkp的特异性电 泳条带，与预计的大小相符，初步证明已成功的扩增出所需要的基因片段，将其回收 Vector载体的克隆位点，构建重组质粒。转 克隆。PCR产物经纯化后，插入pMDl8．T 质粒，用XhoI和Nde I双酶切鉴定，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，插入片段条带大小 正确。用气相色谱测含该重组质粒的大肠杆菌DH5a对毒死蜱的降解能力，24h后对 20mg／L的毒死蜱降解率达39．36％，比出发菌D3降解率高。 关键词：毒死蜱降解菌基因克隆 鸟枪法，印硅因 PcR扩增 lI Abstract isa Organophosphomspesticidechlorpyrifosbroad—spectrum were in used andurbanhealth contr01． insecticides，whichwidely agriculture pest isalsoakindof residuesofwhichisharmful Chlorpyrifos persistentorganicpollutants，the totheenvironment．Soitis forthescientiststo a important develop tosolvethe economical conflictbetween and techniques pesticideapplicationpesticide residueson agricultureproducts． This