柿果acc氧化基因cdna克隆及其植物表达载体的构建.pdfVIP

摘 要 柿果属于跃变型果实，采收后极易软化，给柿果的贮藏运输带来不便。大 量研究证实，乙烯是跃变型成熟果实的催熟激素。跃变型果实中自我催化的乙 烯合成反应启始后，合成大量乙烯。利用转基因技术抑制或降低果实乙烯的生 物合成，可以降低果实乙烯的含量。ACC合成酶和ACC氧化酶是果实乙烯生物 合成的限速酶，通过转基因的方法抑制这两种酶的表达，可望提高跃变型果实 的耐贮性能。本研究以柿果实为材料，克隆分离了富有柿ACC氧化酶基因，成 功构建了该基因的反义和RNA干扰表达载体，结果如下： Mini 1．利用Rneasy回PlantKit试剂盒成功提取了高质量的RNA，RNA的 OD2c,o／OD2so比值为2．0979，为mRNA的反转录奠定了基础。 RT Ⅺt)，分离到完整性好的mRNA，为继后的RT-PCR提供可靠保证。 3．根据已发表的平核无柿ACC氧化酶的保守氨基酸序列，设计了一对特异 DK-AC01基因核苷酸序列及所编码的氨基酸序列同源性达98％，说明克隆到的 片段是富有柿果ACC氧化酶基因片段。 4．通过分析已获得ACC氧化酶基因片段，在内含子两端分别设计含有 EcoRV酶切位点的引物，通过酶切将两个PCR扩增产物连接成一条基因片段， 并转化到大肠杆菌DH5a中经过鉴定及测序，证明得到了去除内含子的基因片 段。 5．用限制性内切酶XbaI和BamH I酶切克隆到的富有柿果ACC氧化酶核 中，构建成中间表达载体pBI．anti．ACO。 6．用Sma 到切除CaMV pSMAK-anti·ACO。 7．用BamHI和Sma 1分别酶切反义中间表达载体质粒pBI．anti．ACO和富 有柿果ACC氧化酶核苷酸序列，将ACC氧化酶的序列正向插入到中间载体 pBI-anti-ACO质粒中，构建成中间表达载体pBI．ACO．RNAi。 8．用Sma 质粒，切下中间载体质粒上的CaMV35S启动子和ACO的反义、正义序列，将 其插入到切除CaMV 载体pSMAK-ACO．RNAi。 到农杆菌EHAl01中，经特异性引物对转化菌液进行PCR扩增，证实表达载体 己转入农杆菌。 关键词：柿果；ACC氧化酶；基因克隆；内含子；植物表达载体 PersimmonACCoxidase andits vector cloningplantexpression gene construction Li Author：Zhang and engineering Major：Primaryproductprocessingstorage JunlianProfessor Supervisor：Ma ZideProfessor Zhang Abstract Persimmonclimacteric difficulttobe and fruit，is storagedtransported fruit，a very