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第五章 医药生物技术产品的后处理工程 重组蛋白质的浓度测定和分子量测定 蛋白质的浓度测定；紫外法比较方便，又不损耗蛋白质样 品。在未知摩尔消光系数的情况下，可以简单地测定280nm 和260nm光吸收值，然后用公式计算： 蛋白质浓度(mg/ml)=1.55A-0.76A260 用考马斯蓝G-250测蛋白质浓度时，是在酸性条件下使试 剂与蛋白质产生反应，其特征吸收率由465nm转移到595nm ， 在一定蛋白质浓度范围内595nm的吸光度与蛋白质浓度成线形 关系，因此可作为定量依据。 凝胶过滤法是测定蛋白质分子量的最常用的方法，已 广泛使用的是Sephadex系列（G-75，G-100等）和HPLC 凝胶过滤系统。SDS是实验室测定蛋白质分子量的 常规方法。 四. 肽谱分析 肽谱分析是用酶解或化学降解（溴化氰法等）目的蛋 白质后对生成的肽段进行的分解分析，它也是检测目的产 物的指标之一。 * * 后处理工程通常称之为下游工程(Downstream Processing); 它泛指从工程细胞或工程菌的大规模培养一直到目的产物的分离纯化、质量控制、产物保存等一系列操作技术，其中最重要的组成部分是产物的分离纯化。 本章主要介绍细胞破碎与固液分离，目的产物的分离纯化，质量控制及产品的保存。 第一节 细胞破碎与固液分离 细胞壁由坚固的多聚糖，乙酰葡萄糖胺和乙酰胞壁酸形成网状结构，这种结构，有一定的阻力，针对这种结构，细胞破碎方法分为机械和非机械两种方法。 机械破碎法 高速匀浆法(High Pressure homogenizer) 高速珠磨法(High-speed bead mill) 超声破碎法(Ultrosonication) 高压挤压法: 本方法是用特殊装置X-Press挤压机. 非机械破碎法 酶溶法(Enzymatic Lysis): 常用的溶酶有溶菌酶(Lysozyme), 葡聚糖酶 (Glucanase), 蛋白酶(Protease), 糖苷酶 (Glycosidase), 甘露糖酶(Mannanase), 肽键内切酶 (Endopeptidase), 壳多糖酶(chitinase)等。 2. 化学渗透法（Chemical Permeation）: 这种方法的优点是： a. 对目的产物的释出有一定的选择性； 细胞外形保持完整，碎片少，有利于进一步分离纯化； 分子量大的核酸释出少，浆液黏度低，有利于提取； 其缺点是： 操作时间长，效率低，一般胞内目的产物释放率不超过 50%，而处理时间在2小时以上，因此为了防止活性损失往往需要加添还原剂（巯基乙醇）进行保护； b. 有些化学试剂本身有毒性，进一步分离纯化时需通过透析等 方法除去所有试剂。 固液分离 离心沉淀: 离心是固液分离的主要手段,其中包括高速离心和超速离心. 过滤: 过滤包括粗滤(布、金属网、纤维滤器等)和膜过滤。 第二节 目的产物的分离纯化 目前分离纯化最好的方法是色谱和电泳，但是受各种因素的限制，电泳远不能用于医药生物技术产品的规模生产上，因此色谱成为人们研究的重点。另外，双水相萃取也是前期分离常用的方法。 双水相萃取 双水相系统由两种水溶高聚物如聚乙二醇~葡聚 糖(PEG-Destran)或一种高聚物与无机盐在水溶液中 混合而成。因两相均含有较多的水,所以称之为双水 相。常用的双水相系统为PEG-Destran和无机盐。由 于Destran价格高，因此PEG-无机盐应用更为广泛。 与色谱分析相比。 双水相萃取所能达到的纯度 还相差较远。 二. 色谱技术 色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的常用手段。其优点是具有多种分离机制、设备简单、便于自动化控制以及分离过程中无发热等有害效应。 色谱技术可分为分析色谱（10mg) 、半制备色谱（10~50mg）、制备色谱（100mg~10g）和工业性生产色谱（20g/d）。 在传统的色谱技术基础上，七十年代以来，发展起来的高效液相色谱（High Perfomance Liquid Chromatography HPLC）引人注目。HPLC的分离原理和常规色谱技术相似，它的特点是具有专有的高压输液系统、灵敏的检测设备和高效分离柱，其优点是分离效率高、选择性好，适用于各种多组分混合物的分离，它的应用范围几乎包括了所有的物质类型，从天然产物到合成产物，从小分子物质到大分子物质，从一般化合物到生