基因工程-创新.pptVIP

目的基因与质粒载体的连接 连接时考虑因素 粘末端连接 定向克隆 平末端连接 同聚物加尾法 加人工接头连接法 目的基因与噬菌体载体的连接 实验步骤要尽可能简单易行; 连接形成的接点序列，应能被某种酶重 新切割，便于回收插入的外源片段； 对转录和转译过程中密码结构的阅读不 发生干扰； 用两种不同的限制酶消化后，应通过凝胶电泳或排阻层析纯化载体大片段，以便切下来的小片段分开； 尽量避免使用在多克隆位点上彼此直接相邻的 酶切位点； 必须检查两种限制酶对载体的消化是否完全 目的基因和载体双酶切反应 盐浓度相同，用同种buffer； 选择易产生星号活性的酶的缓冲液； 酶活性大于50%可选同一种缓冲液； 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解； 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。 人工接头是化学合成的两个自相互补的核苷酸寡聚体（10-12bp），而两个寡聚体可形成带一个或一个以上限制酶切位点的平末端双链寡核苷酸短片段。 载体臂与外源DNA片段的比例 0.25:1—8:1 两种DNA片段在连接混合液中的浓度 1、受体细胞 2、