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第十三章 流式细胞术 流式细胞术（flow cytometry，FCM）是对细胞或细胞颗粒进行定量分析和细胞分类研究的技术。流式细胞仪又称为荧光激活细胞分类器，是流体喷射术、激光光学技术、电子计算机技术和显微荧光光度术相结合的高科技产品。应用流式细胞术可对单细胞逐个地进行高速准确的定量分析和分类，每秒测定达数千到数万个细胞，且有高度的重复性。这种高速信息的测量分析和高纯度分类的新技术，为细胞生物学提供了一种强有力的研究手段。 第一节????? 基本原理 一、流式细胞仪的主要组件 1．液流系统 包括各种管道、压力调节开关、液体流动室和超声振荡器喷嘴。单个细胞悬液在狭窄的管道中流动，由于细胞受流体力学的作用，极易形成贴边、堆积,从而造成阻塞。为克服此种现象，利用流体聚焦的原理，在不同的压力作用下使鞘液（通常用PBS）和细胞悬液在喷嘴内形成层流液束，通过细胞测量区。 2．光学系统 光学系统包括激发光源、各种光学滤片和各种光信号探测器。激光光源通常是采用激光器或汞灯等。激发光束激发细胞所携带的荧光物质产生荧光，通过光电转换器和光电倍增管把微弱的信号变成电的信号，光信号通过不同的滤片把不同波长的光信号分开，把干扰光滤掉。 3．电子系统 电子系统包括各种放大器、模数转换电路、高压电源和各种分析处理辅助系统，还包括把不同细胞分离开来的逻辑控制系统。 4．计算机系统 把从细胞获取的数据记录储存起来，利用各种不同的软件对数据进行分析加工处理，把结果以图、表的形式输出。 二、流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪要求被检细胞用荧光染料染色，呈悬浮状态。经染色的细胞通过样品进入管被压进超声波振荡器喷嘴的中央部，同时将无细胞的液体经过另一进入管压入喷嘴，使之形成包围细胞悬液的鞘液（图13-1）。在鞘液和细胞悬液存在一定压力差的情况下，中央的细胞悬液和周围鞘液的分层液流快速通过50μm的喷嘴圆孔，被喷射出来。当同轴流动的细胞悬液和鞘液通过激光器发出的氩离子激光束照射小区时，单行流动的细胞发射出荧光，荧光检测器接受聚焦后的荧光信号。 多数流式细胞仪可以同时收集两种以上不同波长的荧光信号，检测细胞膜表面或细胞内荧光分子的数量。散射光检测器则接受细胞散射偏转后的激光束信号，此信号可反映细胞的物理化学特性、大小、数量和类型。 前向角散射强度信号与细胞的大小有关。散射光强度信号则反映细胞内部结构，即流式细胞仪可以同时收集两个方向散射光的信号。两种光检测器所产生的信号，经过电子系统的处理，产生脉冲，并使测量过的细胞在形成微滴时，带上不同的电荷（充电）。 当充电微滴通过带有恒定静电压的偏转板时，带正电荷的细胞微滴在静电场作用下落入左方的细胞收集器，而带负电荷的细胞微滴落入右方的细胞收集器，不带电荷的细胞微滴落入中央的容器中，从而实现细胞分选的目的。这种分类技术能以每秒高达5000~10000个细胞的速度分类细胞，纯度在90%~99%之间，细胞活性在通过仪器过程中不受影响。流式细胞仪仅对悬浮细胞进行分析和测量，并进行统计学分析，但无法得到细胞的形态学以及多种动力学功能参数，尤其不能满足细胞的解剖定位研究。 第二节 单细胞悬液的制备 流式细胞术所得结果好坏首先取决于细胞样品处理制备方法的优劣。所以，要保证细胞在制备过程中和储存期间细胞表面和细胞内部的成分不被破坏和去失，特别是要分析的那些成分。 一、单层细胞培养 使用标准培养技术，单层生长的细胞容易分离。单层细胞用PBS或Hanks平衡液加0.25% Trypsin洗，当细胞变圆时（在倒置显微镜下观察），倒出Trypsin液体后用手拍打振动培养瓶使细胞脱落，然后加入缓冲液摇动培养瓶并用细管取出含有细胞的上清液。 二、组织 从新鲜组织制备单个细胞悬液，有的比较容易，例如淋巴结组织用注射器反复抽吸几次即可得到足够量的细胞；有的就比较困难，常要用机械分散和酶消化相结合的方法处理，如肝、睾丸用酶消化处理很容易得到单个细胞。但睾丸生殖细胞胞质之间桥接引起相邻细胞溶解，形成人为的称为合胞体的多核假象。很难与DNA含量和体积上相似的单个细胞区分开。神经细胞的处理参见细胞培养。 三、血细胞制备方法 （一）全血溶解技术 通过选择性的溶解红细胞，获得外周血中单个核细胞和多形核细胞。 1．试剂 氯化铵溶解缓冲液pH7.3。细胞洗涤缓冲液：不含钙镁的Hanks平衡盐液或1×PBS缓冲液。 2