最新第五章基因克隆的载体.ppt

λ噬菌体的基因组，为两端不闭合的线型双链DNA，约占粒子重的54%，分子量为30.8×106道尔顿，48502核苷酸对，长度为17μm，λDNA分子两末端的5’端称为成熟末端，粘性末端由噬菌体颗粒提取的DNA，其线性分子与两端连接呈环状的分子，可成一平衡状态，但环状分子两条链各有一缺口。在DNA分子浓聚的情况，分子末端之间连接，可以发生聚集现象。由于DNA两条链的碱基差异，得到的分开的两条单链，分别称为L和r链（左和右链）。l链的走向是从5’→3’的方向，所以是左向或反时针方向转录，5’末端称为m末端，末端碱基为鸟嘌呤（G）。r链的5’→3’走向与l链相反为右向或顺时针方向转录，链的5’末端称为m’末端，其末端碱基为腺嘌呤（A）。感染进入菌细胞的λDNA两互补端联结，成为环状DNA分子，并由宿主细胞的连接酶将两端的缺口封闭成环状DNA分子，噬菌体进行复制、转录和整合。如在离体的条件下，用DNA聚合酶将此单链的黏性末端补平成双链，DNA就失去其生物活性，不再能有复制和溶原化的能力。 * 早期：确立溶菌反应中期：基因转录结果导致 DNA的复制与重组晚期：基因转录结果导致DNA被包装为成熟蛋白 * 两种不同的复制途径：1）在λ噬菌体感染的早期，环形的 DAN分子按形式从双向进行复制；2）在λ感染的晚期，控制滚环复制机理的开关启动，合成出由一系列线性排列的λ基因组DNA组成的长多连体分子。 * 构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。 * 琥珀和赭石（ochre）突变基因分别是终止密码子UAG和UAA 根据无义突变的三种昵称，三个终止密码子UAA叫赭石（ochre）密码子（相应于赭石突变）；UAG叫琥珀密码子（相应于琥珀突变）；UGA叫蛋白石（opal）密码子（相应于蛋白石突变）。 * 中文名称：体外包装 英文名称：in vitro packaging 定义：在离体条件下，用噬菌体或病毒的蛋白质包裹噬菌体或病毒的裸核酸，组装成有感染性的噬菌体或病毒颗粒的过程。 * 噬菌体体外包装的基本原理 λ噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。 * 感染，即在体外将噬菌体DNA包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。 转染，即在DNA连接酶作用下使噬菌体DNA环化，再象重组质粒一样地转化进受体菌（由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程）。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。 转导（transduction）：以噬菌体颗粒为媒介 转化：以质粒为媒介的转化作用，相对于转化，转染是低效的。 转染效率低的原因：在DNA的体外连接反应中，载体分子同外源DNA片段之间的结合，完全是按一种随机的方式进行的。由此形成的各种重组体分子中有相当的比例是没有活性的。这样的分子不能转染寄主细胞，因而致使转染效率明显下降。 接合、转化、转染、转导、感染等等几个与基因（主要是 DNA ）转移相关的概念1、Conjugation 中文翻译为“结合” Conjugation is the mechanism by which genetic material is transferred between two bacterial cells by plasmids. A cell containing a conjugative plasmid(F+,fertility+)forms a mating pair with a cell that does not contain a conjugative-plasmid(F-)by means of an F-pilus on the surface of the cell.The pilus contracts,pulling the two cells into contact, and the conjugative plasmids(typified by the F plasmid of E.coli ) is transferred from the plasmid-containing cell, the donor, to the recipient(in some cases,pieces of chromosomal DNA is also transfered to the recipient). The tra genes, carried on the F plasmid, contain all the information for the conjugati